嗜熱菌Thermus thermophiles HB8丙酮酸脫氫酶的表達(dá)及其酶動力學(xué)測定.pdf

1、嗜熱酶(thermozymes)是嗜熱菌(thermopHiles)體內(nèi)的一種熱穩(wěn)定性酶,其能夠適應(yīng)自然界中較高的溫度條件并能在該惡劣環(huán)境中保持良好的生理狀態(tài)。由于嗜熱酶所具有的這種特性,其可以在許多依賴高溫條件的工業(yè)生產(chǎn)過程中替代常規(guī)的、不耐熱的化學(xué)試劑和常溫酶,從而提高酶促反應(yīng)速度,降低微生物污染的危險(xiǎn)性,這些特點(diǎn)讓這種酶在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中有更廣闊的應(yīng)用范圍和更低的成本投入、更高的回報(bào)比例,因此這方面的研究具有可觀的經(jīng)濟(jì)前景。本實(shí)驗(yàn)

2、所研究的目的蛋白丙酮酸脫氫酶(E1蛋白)即是這樣一種重要的嗜熱酶。通過催化丙酮酸的氧化脫羧從而為三羧酸循環(huán)和激素合成輸送乙酰輔酶A,丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)在糖代謝中扮演了一個非常關(guān)鍵的角色。E1為PDC的重要組成部分,它催化了整個反應(yīng)體系中非常關(guān)鍵的第一步： 本論文實(shí)驗(yàn)以嗜熱菌thermos thermopHiles HB8為材料,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增大腸桿菌丙酮酸脫氫酶(E1)基因,并將目的基因分別連接到克隆載體pGEM

3、-T和表達(dá)載體pTrcHisC上,構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pTrcHisC-E1在大腸桿菌中于20～25℃的溫度下誘導(dǎo)4～6小時表達(dá)。利用Ni-NTA金屬親和層析的方法從總蛋白中提取E1蛋白,然后通過透析超濾管濃縮獲得純度、濃度較高的E1蛋白溶液,最后采用鐵氰化鉀法對其進(jìn)行酶動力學(xué)測定。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)丙酮酸脫氫酶基因的載體,誘導(dǎo)表達(dá)并純化出了具有酶反應(yīng)活性的丙酮酸脫氫酶,經(jīng)過酶動力學(xué)測定得到該嗜熱菌E1的下列酶活性數(shù)據(jù)：其最適反應(yīng)溫