雙胸蚓組織中一種核酸酶的純化及其底物特異性的研究.pdf

1、目的: 1.雙胸蚓組織中核酸酶粗提物的制備及核酸酶的純化。 2.核酸酶粗提物瓊脂糖凝膠測活體系的建立。 3.純化核酸酶酶學性質(zhì)的研究4.雙胸蚓組織核酸酶底物特異性的初步研究方法: 1.雙胸蚓組織中核酸酶粗提物的制備及核酸酶的純化以SDS-PAGE-DNA功能膠和瓊脂糖凝膠電泳測活相結(jié)合作為雙胸蚓組織核酸酶提取過程中核酸酶活性的監(jiān)測體系。 以碳酸銨處理，熱變性，酸變性及丙酮沉淀后所得粗提物為起點，對

2、核酸酶依次進行柱層析、電泳純化制備雙胸蚓核酸酶樣蛋白質(zhì)純品。 2.核酸酶粗提物瓊脂糖凝膠測活體系的建立以瓊脂糖凝膠電泳作為主要測活體系，研究核酸酶粗提物的最適反應條件。 3.純化核酸酶酶學性質(zhì)的研究采用SDS-PAGE電泳法測定酶分子量，毛細管等點聚焦電泳法測定酶等電點，酶活性測定等方法測定核酸酶的最適pH、最適溫度、溫度穩(wěn)定性、激動劑、抑制劑，計算酶的動力學常數(shù)。 4.雙胸蚓組織核酸酶底物特異性的研究測定DNa

3、se E在最適反應條件下對不同底物的降解速率，證明DNase E降解底物的選擇性；應用瓊脂糖凝膠電泳對DNase E水解雙鏈環(huán)狀DNA后的產(chǎn)物進行鑒定，闡明DNaseE的水解方式。 結(jié)果: 1.雙胸蚓組織中核酸酶粗提物的制備及核酸酶的純化應用本室建立的SDS-PAGE-DNA功能膠測活方法對核酸酶提取過程進行監(jiān)測。在提取過程中產(chǎn)生兩組核酸酶，在SDS-PAGE-DNA功能膠中遷移率較慢的一組采用碳酸銨處理+酸變性+熱變性

4、+丙酮沉淀的提取方法來獲得較好的層析樣品。樣品依次通過四步柱層析，PAGE-DNA功能膠純化得到電泳純的雙胸蚓核酸酶樣蛋白質(zhì)純品，命名為DNase E(Earthworm DNase)。 2.核酸酶粗提物瓊脂糖凝膠測活體系的建立以瓊脂糖凝膠電泳法作為主要測活手段，確定了2μl粒+10μl樣品，樣品溶于0.1MpH5.2NaAc(含20mM Mg2+)緩沖液，37℃共孵育30min后行瓊脂糖凝膠電泳的測活體系。 3.純化核

5、酸酶酶學性質(zhì)的研究對DNase E的酶學性質(zhì)進行了初步研究，結(jié)果表明其分子量約為32kDa，等電點為6.05左右，以小牛胸腺DNA為底物時，反應的最適。pH值為5.2，最適溫度為42℃，其Km值為0.152mg/ml。20mM Mg2+，Ca2+，Mn2+對其活性有一定的激活作用，Zn2+，咪唑，EDTA，K+，Cu2+對其活性有一定的抑制作用，SDS-PAGE的結(jié)果表明DNase E為寡聚肽蛋白質(zhì)，它對酸、堿、有機溶劑穩(wěn)定。

6、4.雙胸蚓組織核酸酶底物特異性的研究通過DNase E在最適反應條件下對幾種不同底物降解速率的研究表明DNase E降解底物存在差異性。應用瓊脂糖凝膠電泳對DNase E水解雙鏈環(huán)狀DNA后的產(chǎn)物進行鑒定，證明了DNaseE屬于核酸內(nèi)切酶。 結(jié)論： 1.確立了雙胸蚓組織核酸酶粗提液的制備工藝，通過柱層析及電泳純化的方法，獲得了一種核酸酶，命名為DNase E(電泳純)，分子量約為32kDa，等電點為6.05左右，反應的最