雙胸蚓組織中一種高等電點(diǎn)核酸酶的分離、純化和活性研究.pdf

1、目的： 1.雙胸蚓組織核酸酶粗提液制備及工藝優(yōu)化； 2.建立雙胸蚓核酸酶分離純化的技術(shù)體系； 3.對(duì)雙胸蚓組織核酸酶的理化性質(zhì)及其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。 方法： 1. 雙胸蚓組織核酸酶粗提液的制備及工藝優(yōu)化觀察不同pH條件下熱變性對(duì)核酸酶提取的影響； 觀察丙酮粉制備及碳酸銨處理對(duì)核酸酶提取的影響； 以PAGE-DNA功能膠和瓊脂糖凝膠電泳測(cè)活相結(jié)合作為雙胸蚓組織核酸酶制備過(guò)程中核酸

2、酶活性的監(jiān)測(cè)體系，針對(duì)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的兩組性質(zhì)不同的核酸酶類，分別采取不同的制備工藝。 2. 雙胸蚓組織核酸酶的層析純化將制備的丙酮粉復(fù)溶液依次進(jìn)行常壓CM陽(yáng)離子交換層析，高壓CM陽(yáng)離子交換層析，高壓HP2疏水層析和RP-HPLC層析，對(duì)雙胸蚓組織中的一組核酸酶進(jìn)行分離純化。 3. 雙胸蚓組織核酸酶的電泳純化和酶學(xué)性質(zhì)研究采用PAGE， 2D-PAGE，PAGE-DNA功能膠，結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色比對(duì)切膠法，對(duì)濃縮的柱層析活性

3、組分進(jìn)行電泳分離；利用SDS-PAGE和Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾兩種方法測(cè)定酶分子量；將該酶分別與環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線狀DNA反應(yīng)，測(cè)定該核酸酶的底物特異性；不同溫度、pH條件對(duì)該核酸酶活力影響；相同溫度和pH條件下金屬離子和電泳中的部分理化因素對(duì)該酶活性的影響。 結(jié)論： 1.進(jìn)一步優(yōu)化了雙胸蚓組織核酸酶粗提液的制備工藝，通過(guò)改變粗提物制備方法和層析策略，最后得到一種高等電點(diǎn)、高活性的核酸酶。 2.活