CYP2E1在1,2-二氯乙烷中毒性腦水腫形成機(jī)制中的作用研究.pdf

1、目的：
　　1，2-二氯乙烷(1，2-Dichloroethane，1，2-DCE)是一種鹵代烴類化合物，主要用于粘合劑、膠粘劑和氯乙烯的生產(chǎn)。1,2-DCE屬高毒類，極易揮發(fā)，職業(yè)接觸主要經(jīng)呼吸道吸收。自上世紀(jì)90年代起，國(guó)內(nèi)多個(gè)省份陸續(xù)發(fā)生多起亞急性1，2-DCE職業(yè)中毒事故，引起了全社會(huì)的廣泛關(guān)注。這些中毒患者的臨床表現(xiàn)以中毒性腦病為主，病理過(guò)程為腦水腫。
　　CYP2E1是細(xì)胞色素P450(Cytochrome P4

2、50，CYP450)的重要亞型，是鹵代烴類化學(xué)物質(zhì)的主要代謝酶之一。1，2-DCE可經(jīng)CYP2E1代謝生成毒性更強(qiáng)的中間產(chǎn)物氯乙醛和2-氯乙醇，并最終代謝為氯乙酸隨尿液排出體外。此外，與其他CYP450亞型相比，CYP2E1具有較強(qiáng)的NADPH氧化酶活性，在代謝底物的過(guò)程中可產(chǎn)生大量活性氧自由基，導(dǎo)致組織細(xì)胞的氧化損傷。
　　許多CYP2E1底物也能影響CYP2E1的表達(dá)，進(jìn)而影響化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)的代謝和毒性作用。已有研究證明，CY

3、P2E1抑制劑能通過(guò)抑制CYP2E1的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)外源性化學(xué)物的肝毒性和致癌作用具有保護(hù)作用。二烯丙基硫化物(Diallylsulfide，DAS)是一種大蒜提取物，是目前公認(rèn)的CYP2E1抑制劑。我們的前期研究結(jié)果也提示，外源性DAS能抑制CYP2E1的表達(dá)，進(jìn)而改善1，2-DCE染毒所致肝損傷。
　　綜上所述，本研究以昆明種小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討CYP2E1在1，2-DCE中毒性腦水腫形成中的作用，為揭示1，2-DCE中毒性腦水

4、腫的形成機(jī)制研究及其防治工作提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。
　　方法：
　　1、CYP2E1對(duì)1，2-DCE體內(nèi)代謝產(chǎn)物的影響
　　將雌性昆明種小鼠隨機(jī)分為單純?nèi)径窘M及干預(yù)組。將DAS溶解于玉米油中，于1，2-DCE染毒前4小時(shí)，干預(yù)組小鼠灌胃給予50mg/kg b.w DAS，單純?nèi)径窘M小鼠灌胃給予玉米油。灌胃的液體體積均為0.2ml。采用靜式吸入方式染毒，每天染毒3.5h，連續(xù)染毒3d，1，2-DCE染毒濃度為1.2g/m3，

5、每天染毒結(jié)束后立即將小鼠置于代謝籠中，收集小鼠3h尿液。
　　2、CYP2E1抑制劑對(duì)1，2-DCE染毒小鼠死亡及行為學(xué)的影響
　　將雌性昆明種小鼠隨機(jī)分為4對(duì)單純?nèi)径窘M及相應(yīng)的干預(yù)組。單純?nèi)径窘M小鼠灌胃給予玉米油，干預(yù)組小鼠灌胃給予50mg/kg b.w DAS。1，2-DCE染毒濃度分別為1.3、1.5、1.7和1.9g/m3，每天染毒3.5h，連續(xù)染毒3d，每天染毒結(jié)束后，記錄小鼠死亡情況。于末次染毒結(jié)束后對(duì)存活小鼠進(jìn)

6、行腦損傷的行為學(xué)觀察。
　　3、CYP2E1抑制劑對(duì)1，2-DCE中毒性腦水腫形成的影響
　　將雌性昆明種小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、單純?nèi)径窘M及低、中和高劑量DAS干預(yù)組。對(duì)照組和單純?nèi)径窘M灌胃給予玉米油。干預(yù)組小鼠分別灌胃給予25、50和100 mg/kg b.w DAS。1，2-DCE染毒濃度為1.2g/m3，每天染毒3.5 h，連續(xù)染毒3d。于末次染毒的次日處死小鼠，快速取腦和肝組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。
　　4、檢測(cè)指

7、標(biāo)
　　(1)腦含水量:腦組織含水量(％)=（濕重-干重）×100/重。
　　(2) GSH含量、MDA含量、SOD活性及肌酐含量:生化試劑盒法。
　　(3)肝微粒體中CYP2E1活性:苯胺羥化酶法。
　　(4)肝和腦組織中CYP2E1的蛋白表達(dá):Western-blot法。
　　(5)肝和腦組織中CYP2E1 mRNA的表達(dá):Real-time PCR。
　　(6)腦組織病理學(xué)觀察:常規(guī)HE染色法。

8、
　　(7)尿中氯乙酸含量:氣相色譜法。
　　(8)小鼠腦損傷行為學(xué)觀察:Berderson評(píng)分法。
　　5、統(tǒng)計(jì)分析
　　采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，正態(tài)分布資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，偏態(tài)分布資料經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后用幾何均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩組間比較采用SNK法，以P＜0.05作為顯著性差異的判定標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　

9、　一、CYP2E1對(duì)1，2-DCE染毒小鼠體內(nèi)1，2-DCE代謝的影響
　　1，2-DCE染毒組小鼠的尿中氯乙酸含量隨著染毒天數(shù)的增加而顯著升高，而干預(yù)組小鼠的尿中氯乙酸含量在染毒期間無(wú)明顯變化。此外，從染毒第2d開(kāi)始，干預(yù)組小鼠的尿中氯乙酸含量顯著低于1，2-DCE染毒組。
　　二、CYP2E1抑制劑對(duì)1，2-DCE染毒小鼠死亡及行為學(xué)的影響
　　1、CYP2E1抑制劑對(duì)1，2-DCE染毒小鼠死亡率的影響
　　

10、隨著染毒劑量的不斷增加，1.3、1.5、1.7和1.9g/m31，2-DCE染毒組小鼠的死亡率不斷升高。當(dāng)1，2-DCE染毒劑量為1.9g/m3時(shí)，單純?nèi)径窘M小鼠的死亡率為80％，而干預(yù)組僅為10％，且兩組的死亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、CYP2E1抑制劑對(duì)1，2-DCE染毒小鼠行為學(xué)的影響
　　將小鼠尾巴輕輕提起使小鼠頭朝下懸空，正常小鼠四肢能夠自然伸展。單純?nèi)径窘M小鼠出現(xiàn)肢體震顫、四肢不能完全伸展，雙前肢和/或雙

11、后肢相互交叉的抱爪現(xiàn)象，即出現(xiàn)腦損傷的行為學(xué)異常表現(xiàn)。
　　對(duì)存活小鼠出現(xiàn)腦損傷行為學(xué)改變（抱爪癥狀）的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單純?nèi)径窘M的存活小鼠中出現(xiàn)腦損傷行為學(xué)異常表現(xiàn)的比例隨著1，2-DCE染毒劑量的增加而不斷升高。其中，當(dāng)染毒劑量為1.3、1.5和1.7g/m3時(shí)，與單純?nèi)径窘M比較，干預(yù)組小鼠出現(xiàn)腦損傷行為學(xué)異常的比例顯著下降。而1.9g/m31，2-DCE單純?nèi)径窘M與干預(yù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　三、CYP2E1抑

12、制劑對(duì)1，2-DCE中毒性腦水腫形成的影響
　　1、小鼠染毒期間的體重變化
　　與對(duì)照組相比，單純?nèi)径窘M小鼠在染毒的第2d體重顯著下降，各干預(yù)組小鼠在染毒的第3d體重顯著下降。與單純?nèi)径窘M相比，中和高劑量干預(yù)組小鼠體重明顯增加。
　　2、CYP2E1抑制劑對(duì)1，2-DCE染毒小鼠肝和腦組織中CYP2E1表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，單純?nèi)径窘M小鼠肝微粒體中CYP2E1酶活性、肝和腦組織中CYP2E1蛋白和mRNA

13、表達(dá)顯著升高。與單純?nèi)径窘M相比，微粒體中CYP2E1酶活性、肝和腦組織中CYP2E1蛋白和mRNA表達(dá)明顯下降。
　　3、CYP2E1抑制劑對(duì)1，2-DCE染毒小鼠腦水腫發(fā)生的影響
　　病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，單純?nèi)径窘M小鼠的腦組織中，細(xì)胞間質(zhì)疏松，細(xì)胞核周?chē)幌对鰧?，胞漿淡染，胞體腫脹變性，邊緣模糊，部分細(xì)胞及毛細(xì)血管周?chē)幌稊U(kuò)張，呈現(xiàn)典型的腦水腫病理改變。干預(yù)組小鼠的腦組織病理學(xué)觀察未見(jiàn)明顯的腦水腫病理改變。
　　與對(duì)照組

14、相比，單純?nèi)径窘M小鼠的腦含水量顯著升高。與單純?nèi)径窘M相比，中和高劑量DAS干預(yù)組小鼠腦含水量顯著下降。
　　4、CYP2E1抑制劑對(duì)1，2-DCE染毒小鼠腦組織氧化損傷的影響
　　與對(duì)照組比較，單純?nèi)径窘M小鼠腦組織中MDA含量顯著升高，而GSH含量顯著下降。各干預(yù)組小鼠的腦組織中MDA含量與單純?nèi)径窘M比較均顯著降低，而GSH含量均顯著升高。各組小鼠腦組織中SOD活性的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、1，