蒙古柳(Salix linearistipularis)耐鹽相關(guān)基因的挖掘研究.pdf

1、松嫩平原鹽堿土壤的pH值在9.2以上，通過對該地區(qū)自然生長的植物資源的調(diào)查發(fā)現(xiàn)分布著約51科184屬的鹽生植物，多數(shù)以草本植物為主，蒙古柳（Salixlinearistipularis）是松嫩平原鹽堿地群落分布的唯一的木本植物，具有較強的耐鹽堿性，是松嫩平原鹽堿地重要的植物資源。
　　本文以蒙古柳為實驗材料分析了鹽脅迫條件下蒙古柳響應逆境的生理特性。利用FOX hunting system技術(shù)將蒙古柳cDNA文庫轉(zhuǎn)入酵母菌和擬南芥

2、，以高NaCl脅迫篩選抗性酵母克隆，建立擬南芥轉(zhuǎn)基因獨立株系。另外以NaCl作為脅迫因素對處理和未處理的兩組蒙古柳植株進行RNA-Seq分析，并對蒙古柳的轉(zhuǎn)錄組與擬南芥轉(zhuǎn)錄組進行了比較研究。
　　本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.蒙古柳資源:在各種非生物脅迫條件下(NaCl、Sorbitol、NaHCO3、H2O2和pH值)對蒙古柳進行了種子萌發(fā)和根長的分析，結(jié)果表明蒙古柳能夠在較高水平脅迫條件下生長，體內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖含

3、量在脅迫條件下有增加的趨勢，蒙古柳是一個抗逆性較強的鹽堿地木本植物。
　　2.酵母水平篩選:通過對酵母文庫的篩選獲得抗鹽克隆15個，序列分析表明大部分和毛果楊基因有高的相似性，其中包括金屬硫蛋白(MT2)、酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIP)基因，已有研究表明這些基因和鹽脅迫相關(guān)。
　　3.轉(zhuǎn)基因擬南芥獨立株系的建立:將蒙古柳cDNA農(nóng)桿菌文庫轉(zhuǎn)入擬南芥，建立轉(zhuǎn)基因擬南芥獨立株系9000多個。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，鑒

4、定產(chǎn)生生物學性狀變化（主要分為葉片大小、株高、分枝數(shù)量、植株倒伏、抽薹時期，果莢長、葉片數(shù)和葉形態(tài)變化）的株系28個。用加入130mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基經(jīng)初步篩選獲得耐鹽株系58個。通過測序和序列比對，一個與毛果楊COP9復合體家族蛋白同源性比較高，一個與小麥的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶SAPK7有高的同源性，這些基因和高滲、鹽、氧化等非生物脅迫有關(guān)。
　　4.SlMT2功能驗證:對在酵母文庫中篩選的蒙古柳金屬硫蛋白(SlMT

5、2)基因的轉(zhuǎn)基因植株（6個株系）解析結(jié)果表明，SlMT2轉(zhuǎn)基因擬南芥在NaCl、NaHCO3、H2O2、CuCl2、ZnCl2、CdCl2和Sorbitol等脅迫培養(yǎng)基中表現(xiàn)出比對照強的抗性，其中在CdCl2培養(yǎng)基中比野生型植株表現(xiàn)出強的抗性。
　　5.蒙古柳轉(zhuǎn)錄組分析:在鹽脅迫下通過轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)包括1397個上調(diào)和1637個下調(diào)基因。通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)2199個基因在50個GO術(shù)語和1103個基因在116個KEGG通路中顯著

6、富集。本研究把蒙古柳基因按照差異程度分成三類:差異表達量在4倍以上和1.5-4倍，將這兩個定義為有差異表達基因;差異表達量在0-1.5倍的基因，定義為沒有差異表達基因，把3個集合的基因富集到的通路分別與擬南芥耐鹽相關(guān)的差異表達基因注釋到的通路進行整合，其中擬南芥鹽脅迫差異表達基因富集的通路分別與蒙古柳差異表達量在＞4倍的基因富集的通路有1個交集，在1.5-4倍的通路的交集有10個（這樣差異表達量≥1.5倍的基因和擬南芥差異表達基因富集的