新型殼聚糖精氨酸衍生物基因載體的構建及其基因傳遞效率的研究.pdf

1、殼聚糖及其衍生物具有良好的生物相容性、生物降解性及優(yōu)越的復合壓縮DNA的能力，在基因載體領域中被廣泛關注。但殼聚糖較差的溶解性及其較低的基因轉染效率在很大程度上限制了其深入開發(fā)和應用。如何提高其基因傳遞效率，一直是研究者們亟待解決的難題。本研究利用精氨酸及聚精氨酸對殼聚糖進行了改性，制備了（聚）精氨酸改性的殼聚糖，繼而將其與質粒復合構建了復合納米粒子，對納米粒子的理化特征和基因傳遞效率進行了系統(tǒng)研究與分析。
　　首先，以殼聚糖為原

2、料與精氨酸及五肽精氨酸按一定配比進行反應，得到精氨酸-殼聚糖和五肽精氨酸-殼聚糖產物。所得產物采用1H NMR核磁對其化學結構進行表征。然后，將兩種產物通過靜電作用和質粒復合，形成穩(wěn)定的復合粒子，對復合粒子的形貌特征、Zeta電位、緩沖能力進行研究和分析，并通過凝膠阻滯實驗研究其復合能力及DNaseⅠ保護能力。最后，按不同的N/P比構建復合粒子，使用HEK-293人胚腎上皮細胞對復合粒子的細胞毒性進行研究，并對其入胞效率、入胞途徑及體外

3、基因傳遞效率進行了系統(tǒng)研究與分析。
　　實驗結果表明，成功制得殼聚糖的衍生物CS-Arg和CS-5Arg，其取代度分別為6.45％和4.90％，分子量分別為21.0k和23.8 k。改性后的殼聚糖具有良好的DNA復合和壓縮能力，均可以同DNA形成穩(wěn)定的復合粒子，復合粒子直徑在100nm左右，平均高度在6-8 nm，形態(tài)分布較均勻，符合納米粒子的特性。改性后殼聚糖的緩沖能力較殼聚糖有明顯提高，其中精氨酸修飾后的殼聚糖緩沖能力為殼聚糖

4、的四倍，五肽精氨酸修飾后的殼聚糖緩沖能力為殼聚糖的兩倍。電位測定結果顯示經（聚）精氨酸修飾的殼聚糖電荷分布在+21至+31 mV范圍內，具有較理想的結合帶負電的質粒的電位電勢值。凝膠阻滯實驗結果表明，CS-Arg、CS-5Arg分別在N/P比8與6時可與質粒完全復合，具有良好的質粒包覆作用。DNaseⅠ保護實驗表明，CS-Arg/pDNA、CS-5Arg/pDNA復合粒子在1U和2U濃度的DNaseⅠ中具有良好的酶保護作用，可避免DNA

5、被DNaseⅠ降解，比殼聚糖具有更為優(yōu)良的酶保護性能。
　　體外轉染試驗中，使用HEK-293細胞株，CCK-8法研究細胞毒性，結果顯示CS-Arg、CS-5Arg與CS-Arg/pDNA、CS-5Arg/pDNA納米粒子均無細胞毒性，（聚）精氨酸修飾殼聚糖的各組與未經修飾的殼聚糖對照組無顯著性差異;細胞內吞實驗中，細胞對復合粒子的吞噬情況具有顯著的時間依賴性，CS-Arg、CS-5Arg較殼聚糖具有更高效的協助質粒入胞的特性;體

6、外轉染實驗結果顯示，經過（聚）精氨酸接枝后的殼聚糖的轉染效率得到的較大程度的提高，與陽性對照PEI的轉染效果接近，但CS-Arg與CS-5Arg二者間無顯著組間差異;復合粒子的胞內示蹤實驗結果顯示，大多數的復合粒子都可以順利地進入到胞內，并且在細胞核和細胞質中均有復合粒子的分布，且觀察到復合粒子在細胞質內發(fā)生解離。
　　研究結果表明，（聚）精氨酸對殼聚糖改性是一種有效提高基因轉染效率的方法，可為殼聚糖基納米粒子作為基因載體用于基因