MLL2促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制及蘿卜籽素抑制肺癌A549細(xì)胞的生物信息學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　肺癌對(duì)人類健康和生活造成巨大危害，并且肺癌五年生存率不到15％，是人類因癌癥死亡的主要原因。許多致癌物質(zhì)都可以通過(guò)癌基因和抑癌基因的激活或抑制促使活細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌癥細(xì)胞。MLL2存在于各種上皮細(xì)胞和組織的癌細(xì)胞中，如前列腺癌，結(jié)腸癌，肺癌和肝癌中被發(fā)現(xiàn)。因?yàn)檫@些腫瘤細(xì)胞中MLL2基因啟動(dòng)子的CpG島的甲基化顯著增加，因此它被認(rèn)為是一種腫瘤基因。本研究主要針對(duì)MLL2對(duì)肺癌細(xì)胞的影響進(jìn)行研究，討論了MLL2基因誘導(dǎo)人肺腺癌

2、 A549細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的可能機(jī)制，研究了肺癌 MLL2基因?qū)M蛋白H3和H4賴氨酸殘基甲基化的影響，最后通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了可能的相關(guān)基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　方法：
　　1、從構(gòu)建過(guò)表達(dá)和基因沉默 MLL2的 A549肺癌細(xì)胞出發(fā)，研究這兩種A549肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。
　　2、通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有MLL2基因的質(zhì)粒，RT-PCR法，WesternBlot，CCK-8細(xì)胞測(cè)定蛋白表達(dá)、以及A549肺

3、癌細(xì)胞增殖和集落形成。
　　3、采用熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測(cè)MLL2，MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）， PKR（雙鏈RNA依賴性蛋白激酶）的mRNA表達(dá)，Western Blot檢測(cè)PKR、MLL2和MMP-2的表達(dá)；用Transwell小室進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞增殖。
　　4、過(guò)表達(dá)和沉默MLL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人肺腺癌A549細(xì)胞，采用Western Blot和免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè) MLL2對(duì) H3K4me

4、3，H3k4me2，H3k4me1，H3K9me3， H3k9me2，H3k9me1，H3k27me3，H3k27me2，H3k27me1，H3k36me3，H3k36me2， H3k36me1，H4k20me3的甲基化狀態(tài)的作用。
　　5、采用R/Bioconductor分析和挖掘基因芯片的數(shù)據(jù)。下載GEO中包含經(jīng)過(guò)蘿卜籽素處理前后的A549肺癌細(xì)胞的原始數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理、質(zhì)控、差異基因的篩選與分析、GO分析、聚類以及通

5、路總結(jié)，進(jìn)一步的分析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及分子相互作用。
　　結(jié)果：
　　我們成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)MLL2的A549肺癌細(xì)胞，通過(guò)MTT法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞過(guò)度表達(dá)MLL2基因，與空載體組和對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)MLL2的細(xì)胞侵襲遷移顯著增加，同類細(xì)胞之間粘附降低，異質(zhì)細(xì)胞粘附則增強(qiáng)了，而且擴(kuò)散加速和集落形成率均發(fā)生了提高。此外，MLL2促使MMP-2 mRNA表達(dá)顯著增加；P-PKR蛋白的表達(dá)則降低；PKR mRNA的表達(dá)與對(duì)照組和空載體

6、組相比無(wú)顯著差異。
　　Western Blot分析表明，MLL2造成H3K9me3的表達(dá)削弱，而沉默MLL2增強(qiáng)H3K9me3的表達(dá)， H3組蛋白20位點(diǎn)和H4組蛋白4、27、36位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)則沒(méi)有顯著差異。免疫熒光表明MLL2造成H3K9me3表達(dá)增強(qiáng)，并且與Western Blot結(jié)果一致。
　　最后，通過(guò)生物信息學(xué)的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了經(jīng)過(guò)蘿卜籽素處理前后A549肺癌細(xì)胞與MLL2相關(guān)的癌基因發(fā)生了下調(diào)。