端粒酶及VEGF-A與宮頸癌浸潤的分子機制研究.pdf

1、子宮頸癌(Cervical cancer)是女性生殖系統(tǒng)最常見惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病例約為50萬，80％以上在發(fā)展中國家，已成為發(fā)展中國家女性的主要致死性疾病。臨床上尚無子宮頸癌高效特異、預后良好的治療手段。特別是子宮頸癌組織浸潤、遠處轉移等問題嚴重阻礙了患者的手術治療，也是后期患者腫瘤復發(fā)、預后差的主要原因，嚴重地降低了患者的存活率。因此，深入研究子宮頸癌浸潤、轉移的高危因素，探索宮頸癌細胞侵潤的分子機制，將有助于子宮頸癌特效

2、治療手段的研發(fā)?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)，部分生物學因素與子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關。HPV感染與宮頸癌的發(fā)病率存在很強的關聯(lián)性，但不是所有病毒感染人群都會進展為宮頸癌，提示其他因素也能影響宮頸病變的發(fā)展進程。人端粒酶是現(xiàn)階段臨床實驗室檢測腫瘤常用的腫瘤標志物；其由三個部分組成，分別是人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、人端粒酶RNA組分(hTERC)和端粒酶協(xié)同蛋白(hTpl)；已經(jīng)發(fā)現(xiàn)端粒酶hTERT mRNA的激活與宮頸癌病變的嚴重程度有明顯相關性

3、。同時，HPV持續(xù)感染引起人體組織的慢性炎癥，分泌種類繁多、作用各異的炎癥因子，包括但不限于COX-2、PGE2、IL-1、MMPs、VEGF，這些炎癥因子會促使正常細胞的變性，最終可能導致腫瘤的發(fā)生。但這些生物學因素與宮頸癌浸潤、轉移是否有關尚未明確。基于此，本研究首先從子宮頸癌關系密切的臨床高危因素出發(fā)，使用相關性分析探索與細胞浸潤密切相關的生物學因素，包括HPV病毒、端粒酶以及炎癥因子等，試圖從大體上明確影響宮頸癌浸潤的高危因素；

4、然后，進一步使用分子生物學手段確定這些相關因素與宮頸癌浸潤之間的相互作用關系；最終明確導致宮頸癌浸潤、轉移的生物學因素，加深對宮頸癌發(fā)生發(fā)展機制的理解，為子宮頸癌特效治療手段的研發(fā)奠定基礎。本研究分為三個部分：
　　第一部分：子宮頸癌浸潤與HPV感染、端粒酶、炎癥因子等相關高風險因素的相關性分析。
　　目的：探索與子宮頸癌浸潤密切相關的生物學因素。
　　方法：收集正常宮頸組織(NCE)20例，宮頸上皮內瘤樣病變II以上

5、(CIN II或III)20例及宮頸鱗癌組織(SCC)20例。PCR法檢測上述各種組織中HPV的感染情況；TRAP-PCR法檢測組織中端粒酶活性水平；ELISA法檢測宮頸鱗癌和正常宮頸組織中炎癥因子（VEGF-A、IL-6、MMP-9、TNF-α、BCL-2及IL-1β）的表達情況。實驗結果及其他臨床高危因素分別與宮頸癌發(fā)展浸潤程度進行相關性分析。
　　結果：CIN和SCC組織均為高危HPV(HPV-16和18)陽性，部分正常組織

6、也為高危HPV陽性。端粒酶活性及hTERT mRNA在宮頸癌、CINⅡ以上病變中明顯異常擴增，但是在正常宮頸組織中幾乎不出現(xiàn)異常擴增；且hTERT mRNA異常表達水平與宮頸病變的嚴重程度呈顯著正相關（p<0.0001）。
　　結論：在六個代表性的炎癥因子中，VEGF-A及其mRNA表達水平與宮頸病變程度正相關（p<0.001）。而且VEGF-A與端粒酶水平見存在正相關。
　　第二部分：VEGF對子宮頸癌Hela細胞株的細胞

7、動力學的影響。
　　目的：研究VEGF-A對子宮頸癌Hela細胞株的細胞動力學的影響。
　　方法：選取體外培養(yǎng)宮頸癌Hela細胞株，依據(jù)RNAi原理，獲得針對VEGF-A基因的siRNA，并轉染體外培養(yǎng)的Hela細胞。觀察其能否特異、高效的抑制細胞中VEGF-A基因及蛋白的表達，及其對Hela細胞增殖能力的影響。
　　結果：利用siRNA技術成功的抑制了Hela細胞株中VEGF-A基因及蛋白的表達，同時Hela細胞在生

8、長、增殖能力有明顯的抑制。
　　結論：VEGF-A參與了宮頸癌Hela細胞株的生長增殖。
　　第三部分：端粒酶對宮頸癌hela細胞VEGF-A分泌的影響及其機制研究。
　　目的：通過體外實驗研究端粒酶hTERT與VEGF在人乳頭狀瘤病毒陽性宮頸癌細胞的關聯(lián)性，了解宮頸癌侵潤發(fā)展的潛在分子機制。
　　方法：分別采用qRT-PCR、ELISA和TRAP-ELISA檢測多種宮頸癌細胞系端粒酶和端粒酶hTERT（端粒酶的

9、限速基因），VEGF mRNA和其蛋白的表達水平。為了探尋端粒酶對宮頸癌細胞VEGF-A分泌的作用，分別構建hTERT shRNA質粒和過表達質粒用于HeLa細胞端粒酶的抑制和過表達實驗。同時研究HPV E6和E7在端粒酶影響VEGF表達中的作用。
　　結果：Hela細胞的端粒酶和VEGF表達水平都很高，且兩者間存在正相關，可用于后續(xù)實驗。抑制hTERT表達下調Hela細胞VEGF的表達，而hTERT的過表達則上調HPV-18陽性