端粒酶及VEGF-A與宮頸癌浸潤(rùn)的分子機(jī)制研究.pdf

1、子宮頸癌(Cervical cancer)是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病例約為50萬(wàn)，80％以上在發(fā)展中國(guó)家，已成為發(fā)展中國(guó)家女性的主要致死性疾病。臨床上尚無(wú)子宮頸癌高效特異、預(yù)后良好的治療手段。特別是子宮頸癌組織浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等問(wèn)題嚴(yán)重阻礙了患者的手術(shù)治療，也是后期患者腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后差的主要原因，嚴(yán)重地降低了患者的存活率。因此，深入研究子宮頸癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的高危因素，探索宮頸癌細(xì)胞侵潤(rùn)的分子機(jī)制，將有助于子宮頸癌特效

2、治療手段的研發(fā)?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)，部分生物學(xué)因素與子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。HPV感染與宮頸癌的發(fā)病率存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，但不是所有病毒感染人群都會(huì)進(jìn)展為宮頸癌，提示其他因素也能影響宮頸病變的發(fā)展進(jìn)程。人端粒酶是現(xiàn)階段臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)腫瘤常用的腫瘤標(biāo)志物；其由三個(gè)部分組成，分別是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)、人端粒酶RNA組分(hTERC)和端粒酶協(xié)同蛋白(hTpl)；已經(jīng)發(fā)現(xiàn)端粒酶hTERT mRNA的激活與宮頸癌病變的嚴(yán)重程度有明顯相關(guān)性

3、。同時(shí)，HPV持續(xù)感染引起人體組織的慢性炎癥，分泌種類繁多、作用各異的炎癥因子，包括但不限于COX-2、PGE2、IL-1、MMPs、VEGF，這些炎癥因子會(huì)促使正常細(xì)胞的變性，最終可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。但這些生物學(xué)因素與宮頸癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是否有關(guān)尚未明確?；诖?，本研究首先從子宮頸癌關(guān)系密切的臨床高危因素出發(fā)，使用相關(guān)性分析探索與細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)的生物學(xué)因素，包括HPV病毒、端粒酶以及炎癥因子等，試圖從大體上明確影響宮頸癌浸潤(rùn)的高危因素；

4、然后，進(jìn)一步使用分子生物學(xué)手段確定這些相關(guān)因素與宮頸癌浸潤(rùn)之間的相互作用關(guān)系；最終明確導(dǎo)致宮頸癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)因素，加深對(duì)宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的理解，為子宮頸癌特效治療手段的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：子宮頸癌浸潤(rùn)與HPV感染、端粒酶、炎癥因子等相關(guān)高風(fēng)險(xiǎn)因素的相關(guān)性分析。
　　目的：探索與子宮頸癌浸潤(rùn)密切相關(guān)的生物學(xué)因素。
　　方法：收集正常宮頸組織(NCE)20例，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變II以上

5、(CIN II或III)20例及宮頸鱗癌組織(SCC)20例。PCR法檢測(cè)上述各種組織中HPV的感染情況；TRAP-PCR法檢測(cè)組織中端粒酶活性水平；ELISA法檢測(cè)宮頸鱗癌和正常宮頸組織中炎癥因子（VEGF-A、IL-6、MMP-9、TNF-α、BCL-2及IL-1β）的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其他臨床高危因素分別與宮頸癌發(fā)展浸潤(rùn)程度進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：CIN和SCC組織均為高危HPV(HPV-16和18)陽(yáng)性，部分正常組織

6、也為高危HPV陽(yáng)性。端粒酶活性及hTERT mRNA在宮頸癌、CINⅡ以上病變中明顯異常擴(kuò)增，但是在正常宮頸組織中幾乎不出現(xiàn)異常擴(kuò)增；且hTERT mRNA異常表達(dá)水平與宮頸病變的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)（p<0.0001）。
　　結(jié)論：在六個(gè)代表性的炎癥因子中，VEGF-A及其mRNA表達(dá)水平與宮頸病變程度正相關(guān)（p<0.001）。而且VEGF-A與端粒酶水平見(jiàn)存在正相關(guān)。
　　第二部分：VEGF對(duì)子宮頸癌Hela細(xì)胞株的細(xì)胞

7、動(dòng)力學(xué)的影響。
　　目的：研究VEGF-A對(duì)子宮頸癌Hela細(xì)胞株的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的影響。
　　方法：選取體外培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞株，依據(jù)RNAi原理，獲得針對(duì)VEGF-A基因的siRNA，并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞。觀察其能否特異、高效的抑制細(xì)胞中VEGF-A基因及蛋白的表達(dá)，及其對(duì)Hela細(xì)胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果：利用siRNA技術(shù)成功的抑制了Hela細(xì)胞株中VEGF-A基因及蛋白的表達(dá)，同時(shí)Hela細(xì)胞在生

8、長(zhǎng)、增殖能力有明顯的抑制。
　　結(jié)論：VEGF-A參與了宮頸癌Hela細(xì)胞株的生長(zhǎng)增殖。
　　第三部分：端粒酶對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞VEGF-A分泌的影響及其機(jī)制研究。
　　目的：通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究端粒酶hTERT與VEGF在人乳頭狀瘤病毒陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞的關(guān)聯(lián)性，了解宮頸癌侵潤(rùn)發(fā)展的潛在分子機(jī)制。
　　方法：分別采用qRT-PCR、ELISA和TRAP-ELISA檢測(cè)多種宮頸癌細(xì)胞系端粒酶和端粒酶hTERT（端粒酶的

9、限速基因），VEGF mRNA和其蛋白的表達(dá)水平。為了探尋端粒酶對(duì)宮頸癌細(xì)胞VEGF-A分泌的作用，分別構(gòu)建hTERT shRNA質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒用于HeLa細(xì)胞端粒酶的抑制和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)研究HPV E6和E7在端粒酶影響VEGF表達(dá)中的作用。
　　結(jié)果：Hela細(xì)胞的端粒酶和VEGF表達(dá)水平都很高，且兩者間存在正相關(guān)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。抑制hTERT表達(dá)下調(diào)Hela細(xì)胞VEGF的表達(dá)，而hTERT的過(guò)表達(dá)則上調(diào)HPV-18陽(yáng)性