內質網(wǎng)壓力響應調節(jié)蛋白HAC1和分子伴侶HSP70在瑞氏木霉中的表達以及重組菌株糖基化模式檢測.pdf

1、絲狀真菌是一種新的極具希望的真核生物表達系統(tǒng)，它不僅具有微生物生長快速、操作簡便等優(yōu)點，還具有真核生物典型的翻譯后修飾作用及強大的蛋白（主要為酶類）分泌能力，近年來，瑞氏木霉已作為基因工程宿主菌應用于外源真核蛋白的生產，但絲狀真菌生產異源蛋白的表達水平遠低于內源蛋白（每升發(fā)酵液數(shù)十克），達不到工業(yè)發(fā)酵規(guī)模的需求。本實驗室前期工作已從多角度研究采取諸如增加基因拷貝數(shù)、利用強啟動子表達等策略以提高外源蛋白的表達，并取得了一定的結果。本論文工

2、作采用過表達非折疊蛋白響應（unfolded protein response，UPR）相關基因的辦法進一步促進外源真核蛋白分泌量的提高。 非折疊蛋白響應（UPR）是調節(jié)蛋白加工分泌的重要機制，當過量表達異源蛋白時，多肽鏈不能及時正確折疊而滯留在內質網(wǎng)內，激活UPR途徑，提高蛋白二硫鍵異構酶和分子伴侶等相關蛋白的表達量，促進內質網(wǎng)內滯留蛋白的重新折疊，從而增加蛋白的分泌量。 本文工作克隆了瑞氏木霉UPR調控基因hca

3、l和分子伴侶hsp70基因，利用重組PCR技術將hacl基因表達盒PgpdA-hacl-TtrpC插入帶有硫胺素抗性基因的自主復制質粒pME2892中，得到hacl表達載體pME-hac；利用相同方法將hsp70基因表達盒PtrpC-hsp-TtrpC插入到帶有硫胺素抗性基因的表達載體T-ptrA中，得到hsp70單表達載體TptrA-hsp；再將其插入到pME-hac中，構建了攜帶有hac和hsp70基因雙表達盒的載體pME-hach

4、sp。 pME-hac、TptrA-hsp和pME-hachsp分別轉化經過初步糖基化改造、同時表達促紅細胞生成素（EPO）的重組菌株T．reesei 47和T．reesei 112，在含有適量抗硫胺素的再生基本培養(yǎng)基平板上篩選，以T．reesei 47為出發(fā)菌株分別得到20、9、4個硫胺素抗性轉化子：以T．reesei 112為出發(fā)菌株分別得到10、12、5個硫胺素抗性的轉化子。在含有抗硫胺素的基本培養(yǎng)基平板上進行復篩，分別

5、挑取單菌落培養(yǎng)經PCR驗證，從6種穩(wěn)定遺傳的轉化子中分別挑選得到T47-hac、T47-hsp、T47-hachsp、T112-hac、T112-hsp和T112-hachsp轉化菌株。 在分子水平和蛋白水平對轉化子T47-hac、T47-hsp、T47-hachsp、T112-hac、T112-hsp和T112-hachsp進行了驗證：southern Blot分析結果證實，hsp基因已經整合到轉化子T47-hsp和T112

6、-hsp的染色體上， hachsp雙基因表達盒已經整合到轉化子T47-hachsp的染色體上。SDS-PAGE檢測顯示，轉化子T47-hsp的胞內總蛋白在約70KD處比出發(fā)菌株T47多1條蛋白帶，這條帶應該就是HSP70蛋白帶，與預期大小相符，證明hsp70基因在T112-hsp中成功表達。 轉化子T47-hsp和T112-hsp胞外蛋白總量及外切纖維二糖水解酶Ⅰ（CBHI）酶活力檢測結果表明，過量表達基因hsp對瑞氏木霉胞

7、外蛋白總量的提高沒有顯著影響，但對CBHI酶活力測定結果顯示T47-hsp菌株的CBHI酶活力比出發(fā)菌株T47提高30％； T112-hsp的CBHI酶活力比出發(fā)菌株T112提高達80％。實驗結果顯示在絲狀真菌中表達UPR途徑相關基因能提高內源或外源蛋白的表達，這是提高工業(yè)菌株外源蛋白產量的一個有效的途徑，對構建具有重要的經濟價值的工業(yè)生產菌株有廣泛的應用前景。 絲狀真菌的蛋白質翻譯后修飾系統(tǒng)與酵母相比，其N-糖基化類型更接近

8、人源糖蛋白的寡聚糖類型，但仍然與哺乳動物存在著一定的差別。為使瑞氏木霉的糖基化修飾系統(tǒng)盡可能與人相同，必須進一步進行遺傳改造。本實驗室前期工作已經得到了兩株對糖基化途徑進行初步改造的瑞氏木霉重組菌株T108和GF4，但還沒有對T108和GF4菌株糖蛋白的糖基化模式進行檢測。本文利用陰離子交換層析柱和葡聚糖凝膠層析柱分離純化了T108、GF4和出發(fā)菌株M23的糖蛋白CBHI。SDS-PAGE檢測結果顯示，T108和GF4的CBHI蛋白分子

9、量都變小，證實T108中表達的N-乙酰葡萄糖氨基轉移酶基因和GF4中敲除α-1，3-甘露糖基轉移酶基因成功表達并改變了糖蛋白的糖基化修飾方式。用糖酰胺酶F酶解CBHI蛋白，釋放糖鏈，進行了SDS-PAGE檢測，切除糖鏈的蛋白和未切除糖鏈的蛋白在SDS-PAGE電泳上由于蛋白分子量變化而出現(xiàn)蛋白條帶遷移，并產生40 KD左右大小的條帶，推測該條帶是被切除的糖類物質。 本實工作證實對瑞氏木霉進行的糖基化改造取得了初步的結果，為瑞氏