鞣酸對(duì)異丙腎上腺素所致心室重構(gòu)和急性心肌損傷的保護(hù)作用與機(jī)制的研究.pdf

1、發(fā)達(dá)國(guó)家的流行病學(xué)研究顯示，高飽和脂肪酸、高脂與高熱量的攝入與心血管疾病的死亡率呈正相關(guān)。然而，低心血管病事件卻在高脂肪攝入的法國(guó)人中出現(xiàn)。這種現(xiàn)象被稱為“法蘭西”悖論，考慮可能與法國(guó)人高紅酒攝入相關(guān)。許多研究表明：紅酒的主要成分之一白藜蘆醇，在“法蘭西悖論”中起到重要作用，但卻不能完全解釋這一現(xiàn)象。鞣酸(Tannic Acid, TA)是植物中廣泛存在的多酚類復(fù)合物，紅葡萄酒中的含量明顯高于白酒。最近研究顯示：TA具有強(qiáng)大的抗氧化，清

2、除氧自由基的能力，抑制脂肪酸氧化，降低甘油三酯和膽固醇等作用。既往研究發(fā)現(xiàn)具有抗氧化特性的藥用植物存在心臟保護(hù)作用。因此，我們推測(cè)除了白藜蘆醇，TA的心臟保護(hù)作用有助于進(jìn)一步解釋“法蘭西悖論”。
　　過(guò)去數(shù)十年心血管疾病研究的進(jìn)展之一主要體現(xiàn)在對(duì)心血管事件鏈的深刻認(rèn)識(shí)。這些認(rèn)識(shí)進(jìn)展使患者在心血管事件鏈的不同階段如多種心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因素，心血管事件高發(fā)，終末期心衰采取不同干預(yù)措施成為可能。通過(guò)阻斷心血管事件鏈，對(duì)心血管事件鏈的多點(diǎn)干

3、預(yù)治療，可預(yù)防或控制心血管疾病進(jìn)展，提高患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生命。目前通過(guò)改良生活習(xí)慣，控制風(fēng)險(xiǎn)因素，優(yōu)化飲食結(jié)構(gòu)，針對(duì)病因治療，應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor,ACE)，血管緊張素酶受體拮抗劑(Angiotensin Receptor Blocker, ARB)，倍他受體阻滯劑(β-receptor antagonist,β-B)，螺內(nèi)酯等藥物已明顯提高了心

4、力衰竭的救治水平和救治效果。通過(guò)上述綜合治療，心力衰竭已取得明顯成績(jī)，挽救了大量患者生命。然而中國(guó)人口巨大，醫(yī)療費(fèi)用占用過(guò)多，只有加強(qiáng)預(yù)防才能實(shí)現(xiàn)心血管疾病的拐點(diǎn)。通過(guò)對(duì)TA的深入研究希望能夠逐漸闡明TA的心血管保護(hù)作用，為預(yù)防心血管疾病和今后的食品工業(yè)提供一些借鑒作用。
　　TA是紅酒中的主要成分之一，是一種多酚類復(fù)合物，各種植物特別是蔬菜，水果中含量豐富，作為食物和飲料被人們廣泛消費(fèi)。食品工業(yè)將其廣泛用于防腐劑和安全的食品添加

5、劑。鞣酸的分子式是C76H52O46(圖1)，由五個(gè)酯?；鸵粋€(gè)糖基構(gòu)成。研究表明TA具有抗基因突變，抗癌和抗菌作用，而TA對(duì)高脂飲食的心血管保護(hù)作用尚未闡明，可能與其抗氧化，清除自由基，抑制脂蛋白氧化，降低血漿甘油三酯和膽固醇水平和其它一些尚未發(fā)現(xiàn)的功能有關(guān)。因此本研究希望能夠探討TA的心血管保護(hù)作用和TA心血管保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　綜上所述，近年來(lái)除白藜蘆醇外，紅酒其它成分的心臟保護(hù)作用逐漸引起人們關(guān)注。TA是紅酒的主要成

6、分之一，然而，TA對(duì)異丙腎上腺素所致心臟損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究未見報(bào)道。本研究論文主要從分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、免疫組化等深入探討TA對(duì)異丙腎上腺素心臟損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，主要包括以下內(nèi)容：1)鞣酸對(duì)異丙腎上腺素所致大鼠心室重構(gòu)的保護(hù)作用及其機(jī)制研究；2)鞣酸對(duì)異丙腎上腺素所致心室重構(gòu)大鼠氧化應(yīng)激、炎癥變化和血脂不良改變的影響；3)鞣酸對(duì)異丙腎上腺素致大鼠急性心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究。
　　第一部分：鞣酸對(duì)異丙腎

7、上腺素所致大鼠心室重構(gòu)的保護(hù)作用及其機(jī)制研究
　　目的：心室重構(gòu)是心血管疾病最重要的靶器官損害之一。本文通過(guò)ISO所致大鼠心室重構(gòu)模型，研究TA對(duì)心室重構(gòu)的影響，及其可能的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：將50只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、異丙腎上腺素組(Isoprenaline,ISO)、鞣酸低劑量組(Little-dose tannic acid,L-TA)、鞣酸中劑量組(Middle-dose tannic acid,M-TA

8、)和鞣酸高劑量組(High-dose tannic acid,H-TA)，每組10只。實(shí)驗(yàn)組給予異丙腎上腺素(ISO)(5mg/kg/d)分三次皮下注射連續(xù)7天制備大鼠心室重構(gòu)(Cardiac remodeling,CR)模型；空白對(duì)照組大鼠皮下注射相應(yīng)體積的0.9％NaCI。ISO皮下注射1周后，TA干預(yù)組分別灌胃給予L-TA、M-TA、H-TA，持續(xù)兩周。ISO組和空白對(duì)照組均灌胃給予等量0.9%NaCI。
　　結(jié)果：

9、　　1、 TA對(duì)ISO致心室重構(gòu)大鼠心臟功能的影響
　　ISO連續(xù)皮下注射7d，大鼠?dp/dtmax和LVEDP的數(shù)值明顯高于空白對(duì)照組，而+dp/dtmax明顯低于空白對(duì)照組，HR和LVSP變化不明顯。L-TA、M-TA和H-TA均能降低大鼠心臟?dp/dtmax和LVEDP的數(shù)值；同時(shí)提高+dp/dtmax，與ISO組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；研究顯示：TA的效果有劑量依賴性。
　　2、TA對(duì)ISO致心

10、室重構(gòu)大鼠心臟重量、左室重量、心重指數(shù)(HW/BW and LVW/BW)的影響
　　給予ISO連續(xù)皮下注射7d可引起大鼠心臟明顯增大，HW、LVW明顯增加，以及HW/BW、LVW/BW兩指數(shù)明顯增加，較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A)。TA(20、40mg及60mg/kg/d)實(shí)驗(yàn)治療2周后，能明顯抑制心臟的肥大，HW/BW、LVW/BW兩指數(shù)明顯下降，較ISO組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。
　　3、

11、 TA對(duì)ISO所致心室重構(gòu)大鼠CVF和PVCA的影響
　　HE和VG染色顯示:大鼠組織標(biāo)本在光鏡下觀察，HE染色可見 ISO使心肌纖維縱徑和CSA明顯增加較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。VG染色顯示：心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)較對(duì)照組明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。顯示心肌細(xì)胞呈黃色，膠原纖維呈紅色。正常對(duì)照組顯示：心肌膠原纖維含量較少，心肌纖維豐富，心肌間質(zhì)CVF和和血管周圍PVCA比例較低。ISO組心肌膠原纖維明顯增多

12、，心肌纖維減少，ISO組心肌間質(zhì)CVF和血管周圍PVCA明顯增高。通過(guò)心肌膠原含量的半定量分析，ISO組心肌間質(zhì)CVF和血管周圍PVCA與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； ISO致心室重構(gòu)大鼠，經(jīng)過(guò) TA(20、40及60 mg·kg?1)2周處理，VG染色可見心肌纖維明顯增加，膠原纖維減少，心肌間質(zhì)CVF和血管周圍PVCA明顯降低與ISO組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　4、 TA對(duì)ISO所致心

13、室重構(gòu)大鼠心肌組織中羥脯氨酸(Hyp)和血清中腦鈉肽(BNP)含量的影響
　　從研究結(jié)果可見，與Contral組相比，ISO組的大鼠心肌組織中Hyp含量明顯增加(P<0.01)。而經(jīng)L-TA，M-TA，H-TA實(shí)驗(yàn)治療2周后，各處理組的大鼠心肌組織中Hyp含量明顯減少，與ISO組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果所示，ISO組的大鼠血清中BNP含量較control組明顯升高(P<0.01)。給予L-TA

14、治療2周后，與ISO組比較，大鼠血清中BNP含量有降低的趨勢(shì)，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給予M-TA、H-T治療2周后，大鼠血清中BNP含量有降低的趨勢(shì)明顯(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、 TA對(duì)ISO所致心室重構(gòu)大鼠心肌中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3水平和NF-κB的影響
　　Western-blot結(jié)果顯示，與Control組比較，ISO組的大鼠心肌組織中Bax/Bcl-2比值和 C

15、aspase-3水平和 NF-κB明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予TA20,40,60mg/kg治療2周后，可以抑制大鼠心肌組織中Bax/Bcl-2比值、Caspase-3和NF-κB表達(dá)水平，與ISO組比較，L-TA、M-TA(P<0.05)、H-TA(P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：TA可劑量依賴性的改善ISO致心臟重構(gòu)大鼠的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，降低心臟肥厚參數(shù)，減少心肌形態(tài)學(xué)變化，抑制心肌纖維化，減少Hy

16、p和BNP含量；其可能機(jī)制是下調(diào)Bax/Bcl-2比值和Caspase-3水平和NF-κB水平。
　　第二部分：鞣酸對(duì)異丙腎上腺素所致心室重構(gòu)大鼠氧化應(yīng)激、炎癥變化和血脂不良改變的影響
　　目的：研究TA對(duì)ISO致心室重構(gòu)大鼠氧化應(yīng)激、炎癥變化和血脂不良代謝的影響
　　方法：分組及給藥方法同“第一部分”。
　　結(jié)果：
　　1、 TA對(duì)ISO致心室重構(gòu)大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px活性及CAT、MDA濃度

17、影響
　　研究發(fā)現(xiàn)：ISO組與對(duì)照組相比，MDA水平明顯增高(P<0.01)，CAT的水平明顯降低(P<0.01)；SOD和GSH-Px活性明顯下降(P<0.05,P<0.01)。經(jīng)過(guò)2周L-TA、M-TA、H-TA處理，MDA水平明顯降低(P<0.01)，而CAT水平明顯提高(P<0.01)；L-TA SOD活性有增加趨勢(shì)，較ISO增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；M-TA組 SOD活性增加明顯(P<0.05)；而H-TA組SO

18、D活性增加更加明顯(P<0.01)。 TA各劑量組處理GSH-Px活性均明顯增加(P<0.01)。
　　2、 TA對(duì)ISO致心室重構(gòu)大鼠心室組織中IL-1β、TNF-α、c-fos，c-jun的表達(dá)的影響
　　炎癥因子IL-1β、TNF-α、c-fos，c-jun在正常細(xì)胞中表達(dá)水平非常低，表達(dá)增加與細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)明顯相關(guān)。ISO致心室重構(gòu)大鼠模型顯示IL-1β、TNF-α、c-fos，c-jun表達(dá)明顯增加(P<0.0

19、1)。經(jīng)過(guò)TA2周處理后， IL-1β、TNF-α、c-fos，c-jun表達(dá)較ISO組明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　3 TA對(duì)ISO致心室重構(gòu)大鼠血清中CPR水平影響
　　對(duì)照組CPR濃度較低，ISO組CPR濃度明顯增加。經(jīng)過(guò)TA處理后CPR濃度明顯降低較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究同時(shí)表明：TA降低CPR濃度具有劑量依賴性。
　　4 TA對(duì)ISO致心室重構(gòu)大鼠血脂的干預(yù)作用
　　I

20、SO組大鼠血清中TC、LDL、VLDL、TG游離脂肪酸、磷脂等血脂水平明顯增加，而HDL水平明顯降低，較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)。經(jīng)過(guò)TA處理后，TC、LDL、VLDL、TG游離脂肪酸、磷脂等血脂水平明顯降低， HDL水平明顯升高(P<0.01)，但20 mg/kg低劑量TA組TC, HDL, VLDL,TG游離脂肪酸和磷脂有一定變化，與ISO組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：結(jié)果表明:TA抑制ISO致心臟重構(gòu)大鼠的氧化應(yīng)

21、激水平、炎癥表達(dá)、調(diào)節(jié)血脂代謝，對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用；其可能機(jī)制是下調(diào)IL-1β、TNF-α、c-fos，c-jun等炎癥因子的表達(dá)。
　　第三部分：鞣酸對(duì)異丙腎上腺素致大鼠急性心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的：測(cè)定異丙腎上腺素誘發(fā)急性心肌損傷大鼠的心電圖、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、心肌酶、內(nèi)皮素-1與NO濃度，c-fos、c-jun、IL-1β、TNF-α、Bax/Bcl-2、caspase-3和-9蛋白表達(dá)；探討TA對(duì)異丙腎

22、上腺素所致大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　方法：將50只雄性SD大鼠，體重(180-220g)，由河北醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、ISO組、維拉帕米組(Verapamil,VER)、L-TA組（20mg/kg/d）和H-TA(40mg/kg/d)組。對(duì)照組和ISO組腹腔注射(Intraperitoneally,i.p)0.9%NaCI(0.1mg/kg/d)，VER組給予維拉帕米2mg/kg/d腹腔

23、注射，低、高劑量組，大鼠分別給予TA(20mg/kg/d,40mg/kg/d)灌胃進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理7天后，試驗(yàn)組予ISO8mg/kg腹腔注射；對(duì)照組接受等容積的0.9%NaCI腹腔注射，腹腔注射6小時(shí)后進(jìn)行相關(guān)參數(shù)檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1、 TA對(duì)ISO致急性心肌損傷大鼠心電圖和心臟血流動(dòng)力學(xué)的影響
　　ISO組與對(duì)照組比較心電圖ST段明顯抬高，血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)：心率、LVEDP明顯增加，±dp/dtmax變化幅度降

24、低；而TA與VER組各項(xiàng)參數(shù)恢復(fù)接近正常水平，且體現(xiàn)劑量依賴性。注射ISO之前，預(yù)處理各組較對(duì)照組各項(xiàng)參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異。
　　2、 TA對(duì)ISO致急性心肌損傷大鼠心肌酶和內(nèi)皮功能的影響
　　對(duì)照組和試驗(yàn)組血清CK、CK-MB、LDH、ET-1和NO發(fā)生明顯變化。ISO大劑量腹腔注射后心肌酶各項(xiàng)指標(biāo)明顯增加(CK增加53.61%,CK-MB增加79.05%,LDH增加42.56%)，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)

25、過(guò)TA和VER預(yù)處理1周，心肌酶各項(xiàng)指標(biāo)明顯降低(P<0.05,P<0.01)接近正常水平。ISO處理后ET-1水平同樣出現(xiàn)明顯增高(P<0.01)，經(jīng)過(guò)TA和VER預(yù)處理1周后各組ET-1水平明顯降低。相反NO水平在ISO組明顯降低，經(jīng)過(guò)TA和VER預(yù)處理明顯增加(P<0.01)，接近正常水平。
　　3、 TA對(duì)ISO誘發(fā)急性心肌損傷大鼠的心肌組織病理形態(tài)學(xué)分析
　　各組大鼠H&E染色切片的典型表現(xiàn)各不相同。正常對(duì)照組未見

26、心肌組織壞死、水腫和炎癥，而ISO組可見波狀纖維，心肌纖維丟失，廣泛的心肌壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，明顯心肌細(xì)胞水腫和空泡化。TA低劑量、高劑量組和VER組可見心肌細(xì)胞炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌壞死和水腫較對(duì)照組明顯降低。而且進(jìn)展性的心肌空泡化較ISO組明顯減弱。
　　4、 TA對(duì)ISO誘發(fā)急性心肌損傷大鼠的心肌組織中SOD、GSH-Px活性及CAT、MDA濃度影響
　　ISO處理組較對(duì)照組MDA水平明顯增高(112.41%,P<0.01

27、)，CAT明顯下降(48.87%,P<0.01)。ISO致急性心肌損傷大鼠的心肌組織中組SOD下降(61.77%,P<0.01)和GSH-Px的活性也明顯降低(51.70%,P<0.01)。與ISO組相比，經(jīng)過(guò)不同劑量TA和VER預(yù)處理各項(xiàng)參數(shù)接近正常水平，與ISO有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5、 TA對(duì)ISO致急性心肌損傷大鼠心肌組織中c-fos、c-jun、IL-1β、TNF-α、Bax/Bcl-2、caspase-3和-9蛋白表達(dá)的

28、影響
　　大鼠心肌組織中c-fos、c-jun、IL-1β、TNF-α、Bax/Bcl-2、NF-κB、caspase-3和-9蛋白表達(dá)與細(xì)胞損傷、炎癥和細(xì)胞凋亡相關(guān)，在正常對(duì)照組相關(guān)蛋白表達(dá)較低(Fig.5,Fig.6和Fig.7)。經(jīng)過(guò)ISO腹腔注射導(dǎo)致急性心肌損傷可見上述蛋白在大鼠心肌組織中的表達(dá)明顯增加較對(duì)照組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)過(guò)TA不同劑量預(yù)處理和VER預(yù)處理上述蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，較ISO有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意