鞣酸對異丙腎上腺素所致心室重構(gòu)和急性心肌損傷的保護作用與機制的研究.pdf

1、發(fā)達國家的流行病學研究顯示，高飽和脂肪酸、高脂與高熱量的攝入與心血管疾病的死亡率呈正相關。然而，低心血管病事件卻在高脂肪攝入的法國人中出現(xiàn)。這種現(xiàn)象被稱為“法蘭西”悖論，考慮可能與法國人高紅酒攝入相關。許多研究表明：紅酒的主要成分之一白藜蘆醇，在“法蘭西悖論”中起到重要作用，但卻不能完全解釋這一現(xiàn)象。鞣酸(Tannic Acid, TA)是植物中廣泛存在的多酚類復合物，紅葡萄酒中的含量明顯高于白酒。最近研究顯示：TA具有強大的抗氧化，清

2、除氧自由基的能力，抑制脂肪酸氧化，降低甘油三酯和膽固醇等作用。既往研究發(fā)現(xiàn)具有抗氧化特性的藥用植物存在心臟保護作用。因此，我們推測除了白藜蘆醇，TA的心臟保護作用有助于進一步解釋“法蘭西悖論”。
　　過去數(shù)十年心血管疾病研究的進展之一主要體現(xiàn)在對心血管事件鏈的深刻認識。這些認識進展使患者在心血管事件鏈的不同階段如多種心血管疾病風險因素，心血管事件高發(fā)，終末期心衰采取不同干預措施成為可能。通過阻斷心血管事件鏈，對心血管事件鏈的多點干

3、預治療，可預防或控制心血管疾病進展，提高患者生活質(zhì)量，延長患者生命。目前通過改良生活習慣，控制風險因素，優(yōu)化飲食結(jié)構(gòu)，針對病因治療，應用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor,ACE)，血管緊張素酶受體拮抗劑(Angiotensin Receptor Blocker, ARB)，倍他受體阻滯劑(β-receptor antagonist,β-B)，螺內(nèi)酯等藥物已明顯提高了心

4、力衰竭的救治水平和救治效果。通過上述綜合治療，心力衰竭已取得明顯成績，挽救了大量患者生命。然而中國人口巨大，醫(yī)療費用占用過多，只有加強預防才能實現(xiàn)心血管疾病的拐點。通過對TA的深入研究希望能夠逐漸闡明TA的心血管保護作用，為預防心血管疾病和今后的食品工業(yè)提供一些借鑒作用。
　　TA是紅酒中的主要成分之一，是一種多酚類復合物，各種植物特別是蔬菜，水果中含量豐富，作為食物和飲料被人們廣泛消費。食品工業(yè)將其廣泛用于防腐劑和安全的食品添加

5、劑。鞣酸的分子式是C76H52O46(圖1)，由五個酯?；鸵粋€糖基構(gòu)成。研究表明TA具有抗基因突變，抗癌和抗菌作用，而TA對高脂飲食的心血管保護作用尚未闡明，可能與其抗氧化，清除自由基，抑制脂蛋白氧化，降低血漿甘油三酯和膽固醇水平和其它一些尚未發(fā)現(xiàn)的功能有關。因此本研究希望能夠探討TA的心血管保護作用和TA心血管保護作用的可能機制。
　　綜上所述，近年來除白藜蘆醇外，紅酒其它成分的心臟保護作用逐漸引起人們關注。TA是紅酒的主要成

6、分之一，然而，TA對異丙腎上腺素所致心臟損傷的保護作用及其機制的研究未見報道。本研究論文主要從分子生物學、形態(tài)學、細胞學、免疫組化等深入探討TA對異丙腎上腺素心臟損傷的保護作用及其機制，主要包括以下內(nèi)容：1)鞣酸對異丙腎上腺素所致大鼠心室重構(gòu)的保護作用及其機制研究；2)鞣酸對異丙腎上腺素所致心室重構(gòu)大鼠氧化應激、炎癥變化和血脂不良改變的影響；3)鞣酸對異丙腎上腺素致大鼠急性心肌損傷的保護作用及機制研究。
　　第一部分：鞣酸對異丙腎

7、上腺素所致大鼠心室重構(gòu)的保護作用及其機制研究
　　目的：心室重構(gòu)是心血管疾病最重要的靶器官損害之一。本文通過ISO所致大鼠心室重構(gòu)模型，研究TA對心室重構(gòu)的影響，及其可能的保護機制。
　　方法：將50只實驗大鼠隨機分為5組：對照組、異丙腎上腺素組(Isoprenaline,ISO)、鞣酸低劑量組(Little-dose tannic acid,L-TA)、鞣酸中劑量組(Middle-dose tannic acid,M-TA

8、)和鞣酸高劑量組(High-dose tannic acid,H-TA)，每組10只。實驗組給予異丙腎上腺素(ISO)(5mg/kg/d)分三次皮下注射連續(xù)7天制備大鼠心室重構(gòu)(Cardiac remodeling,CR)模型；空白對照組大鼠皮下注射相應體積的0.9％NaCI。ISO皮下注射1周后，TA干預組分別灌胃給予L-TA、M-TA、H-TA，持續(xù)兩周。ISO組和空白對照組均灌胃給予等量0.9%NaCI。
　　結(jié)果：

9、　　1、 TA對ISO致心室重構(gòu)大鼠心臟功能的影響
　　ISO連續(xù)皮下注射7d，大鼠?dp/dtmax和LVEDP的數(shù)值明顯高于空白對照組，而+dp/dtmax明顯低于空白對照組，HR和LVSP變化不明顯。L-TA、M-TA和H-TA均能降低大鼠心臟?dp/dtmax和LVEDP的數(shù)值；同時提高+dp/dtmax，與ISO組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；研究顯示：TA的效果有劑量依賴性。
　　2、TA對ISO致心

10、室重構(gòu)大鼠心臟重量、左室重量、心重指數(shù)(HW/BW and LVW/BW)的影響
　　給予ISO連續(xù)皮下注射7d可引起大鼠心臟明顯增大，HW、LVW明顯增加，以及HW/BW、LVW/BW兩指數(shù)明顯增加，較對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1A)。TA(20、40mg及60mg/kg/d)實驗治療2周后，能明顯抑制心臟的肥大，HW/BW、LVW/BW兩指數(shù)明顯下降，較ISO組差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。
　　3、

11、 TA對ISO所致心室重構(gòu)大鼠CVF和PVCA的影響
　　HE和VG染色顯示:大鼠組織標本在光鏡下觀察，HE染色可見 ISO使心肌纖維縱徑和CSA明顯增加較對照組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。VG染色顯示：心肌間質(zhì)膠原容積分數(shù)較對照組明顯增加，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。顯示心肌細胞呈黃色，膠原纖維呈紅色。正常對照組顯示：心肌膠原纖維含量較少，心肌纖維豐富，心肌間質(zhì)CVF和和血管周圍PVCA比例較低。ISO組心肌膠原纖維明顯增多

12、，心肌纖維減少，ISO組心肌間質(zhì)CVF和血管周圍PVCA明顯增高。通過心肌膠原含量的半定量分析，ISO組心肌間質(zhì)CVF和血管周圍PVCA與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)； ISO致心室重構(gòu)大鼠，經(jīng)過 TA(20、40及60 mg·kg?1)2周處理，VG染色可見心肌纖維明顯增加，膠原纖維減少，心肌間質(zhì)CVF和血管周圍PVCA明顯降低與ISO組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　4、 TA對ISO所致心

13、室重構(gòu)大鼠心肌組織中羥脯氨酸(Hyp)和血清中腦鈉肽(BNP)含量的影響
　　從研究結(jié)果可見，與Contral組相比，ISO組的大鼠心肌組織中Hyp含量明顯增加(P<0.01)。而經(jīng)L-TA，M-TA，H-TA實驗治療2周后，各處理組的大鼠心肌組織中Hyp含量明顯減少，與ISO組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果所示，ISO組的大鼠血清中BNP含量較control組明顯升高(P<0.01)。給予L-TA

14、治療2周后，與ISO組比較，大鼠血清中BNP含量有降低的趨勢，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；給予M-TA、H-T治療2周后，大鼠血清中BNP含量有降低的趨勢明顯(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　5、 TA對ISO所致心室重構(gòu)大鼠心肌中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3水平和NF-κB的影響
　　Western-blot結(jié)果顯示，與Control組比較，ISO組的大鼠心肌組織中Bax/Bcl-2比值和 C

15、aspase-3水平和 NF-κB明顯增加，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。給予TA20,40,60mg/kg治療2周后，可以抑制大鼠心肌組織中Bax/Bcl-2比值、Caspase-3和NF-κB表達水平，與ISO組比較，L-TA、M-TA(P<0.05)、H-TA(P<0.01)差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：TA可劑量依賴性的改善ISO致心臟重構(gòu)大鼠的血流動力學參數(shù)，降低心臟肥厚參數(shù)，減少心肌形態(tài)學變化，抑制心肌纖維化，減少Hy

16、p和BNP含量；其可能機制是下調(diào)Bax/Bcl-2比值和Caspase-3水平和NF-κB水平。
　　第二部分：鞣酸對異丙腎上腺素所致心室重構(gòu)大鼠氧化應激、炎癥變化和血脂不良改變的影響
　　目的：研究TA對ISO致心室重構(gòu)大鼠氧化應激、炎癥變化和血脂不良代謝的影響
　　方法：分組及給藥方法同“第一部分”。
　　結(jié)果：
　　1、 TA對ISO致心室重構(gòu)大鼠心肌組織中SOD、GSH-Px活性及CAT、MDA濃度

17、影響
　　研究發(fā)現(xiàn)：ISO組與對照組相比，MDA水平明顯增高(P<0.01)，CAT的水平明顯降低(P<0.01)；SOD和GSH-Px活性明顯下降(P<0.05,P<0.01)。經(jīng)過2周L-TA、M-TA、H-TA處理，MDA水平明顯降低(P<0.01)，而CAT水平明顯提高(P<0.01)；L-TA SOD活性有增加趨勢，較ISO增加無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；M-TA組 SOD活性增加明顯(P<0.05)；而H-TA組SO

18、D活性增加更加明顯(P<0.01)。 TA各劑量組處理GSH-Px活性均明顯增加(P<0.01)。
　　2、 TA對ISO致心室重構(gòu)大鼠心室組織中IL-1β、TNF-α、c-fos，c-jun的表達的影響
　　炎癥因子IL-1β、TNF-α、c-fos，c-jun在正常細胞中表達水平非常低，表達增加與細胞損傷和炎癥反應明顯相關。ISO致心室重構(gòu)大鼠模型顯示IL-1β、TNF-α、c-fos，c-jun表達明顯增加(P<0.0

19、1)。經(jīng)過TA2周處理后， IL-1β、TNF-α、c-fos，c-jun表達較ISO組明顯下降，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　3 TA對ISO致心室重構(gòu)大鼠血清中CPR水平影響
　　對照組CPR濃度較低，ISO組CPR濃度明顯增加。經(jīng)過TA處理后CPR濃度明顯降低較對照組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。研究同時表明：TA降低CPR濃度具有劑量依賴性。
　　4 TA對ISO致心室重構(gòu)大鼠血脂的干預作用
　　I

20、SO組大鼠血清中TC、LDL、VLDL、TG游離脂肪酸、磷脂等血脂水平明顯增加，而HDL水平明顯降低，較對照組差異有統(tǒng)計。經(jīng)過TA處理后，TC、LDL、VLDL、TG游離脂肪酸、磷脂等血脂水平明顯降低， HDL水平明顯升高(P<0.01)，但20 mg/kg低劑量TA組TC, HDL, VLDL,TG游離脂肪酸和磷脂有一定變化，與ISO組相比沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：結(jié)果表明:TA抑制ISO致心臟重構(gòu)大鼠的氧化應

21、激水平、炎癥表達、調(diào)節(jié)血脂代謝，對心肌細胞起保護作用；其可能機制是下調(diào)IL-1β、TNF-α、c-fos，c-jun等炎癥因子的表達。
　　第三部分：鞣酸對異丙腎上腺素致大鼠急性心肌損傷的保護作用及機制研究
　　目的：測定異丙腎上腺素誘發(fā)急性心肌損傷大鼠的心電圖、血流動力學指標、心肌酶、內(nèi)皮素-1與NO濃度，c-fos、c-jun、IL-1β、TNF-α、Bax/Bcl-2、caspase-3和-9蛋白表達；探討TA對異丙腎

22、上腺素所致大鼠心肌損傷的保護作用及機制。
　　方法：將50只雄性SD大鼠，體重(180-220g)，由河北醫(yī)科大學試驗動物中心提供。實驗大鼠隨機分為5組：對照組、ISO組、維拉帕米組(Verapamil,VER)、L-TA組（20mg/kg/d）和H-TA(40mg/kg/d)組。對照組和ISO組腹腔注射(Intraperitoneally,i.p)0.9%NaCI(0.1mg/kg/d)，VER組給予維拉帕米2mg/kg/d腹腔

23、注射，低、高劑量組，大鼠分別給予TA(20mg/kg/d,40mg/kg/d)灌胃進行預處理。預處理7天后，試驗組予ISO8mg/kg腹腔注射；對照組接受等容積的0.9%NaCI腹腔注射，腹腔注射6小時后進行相關參數(shù)檢測。
　　結(jié)果：
　　1、 TA對ISO致急性心肌損傷大鼠心電圖和心臟血流動力學的影響
　　ISO組與對照組比較心電圖ST段明顯抬高，血流動力學參數(shù)：心率、LVEDP明顯增加，±dp/dtmax變化幅度降

24、低；而TA與VER組各項參數(shù)恢復接近正常水平，且體現(xiàn)劑量依賴性。注射ISO之前，預處理各組較對照組各項參數(shù)統(tǒng)計學無差異。
　　2、 TA對ISO致急性心肌損傷大鼠心肌酶和內(nèi)皮功能的影響
　　對照組和試驗組血清CK、CK-MB、LDH、ET-1和NO發(fā)生明顯變化。ISO大劑量腹腔注射后心肌酶各項指標明顯增加(CK增加53.61%,CK-MB增加79.05%,LDH增加42.56%)，與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。經(jīng)

25、過TA和VER預處理1周，心肌酶各項指標明顯降低(P<0.05,P<0.01)接近正常水平。ISO處理后ET-1水平同樣出現(xiàn)明顯增高(P<0.01)，經(jīng)過TA和VER預處理1周后各組ET-1水平明顯降低。相反NO水平在ISO組明顯降低，經(jīng)過TA和VER預處理明顯增加(P<0.01)，接近正常水平。
　　3、 TA對ISO誘發(fā)急性心肌損傷大鼠的心肌組織病理形態(tài)學分析
　　各組大鼠H&E染色切片的典型表現(xiàn)各不相同。正常對照組未見

26、心肌組織壞死、水腫和炎癥，而ISO組可見波狀纖維，心肌纖維丟失，廣泛的心肌壞死，炎癥細胞浸潤，明顯心肌細胞水腫和空泡化。TA低劑量、高劑量組和VER組可見心肌細胞炎癥細胞浸潤，心肌壞死和水腫較對照組明顯降低。而且進展性的心肌空泡化較ISO組明顯減弱。
　　4、 TA對ISO誘發(fā)急性心肌損傷大鼠的心肌組織中SOD、GSH-Px活性及CAT、MDA濃度影響
　　ISO處理組較對照組MDA水平明顯增高(112.41%,P<0.01

27、)，CAT明顯下降(48.87%,P<0.01)。ISO致急性心肌損傷大鼠的心肌組織中組SOD下降(61.77%,P<0.01)和GSH-Px的活性也明顯降低(51.70%,P<0.01)。與ISO組相比，經(jīng)過不同劑量TA和VER預處理各項參數(shù)接近正常水平，與ISO有統(tǒng)計學差異。
　　5、 TA對ISO致急性心肌損傷大鼠心肌組織中c-fos、c-jun、IL-1β、TNF-α、Bax/Bcl-2、caspase-3和-9蛋白表達的

28、影響
　　大鼠心肌組織中c-fos、c-jun、IL-1β、TNF-α、Bax/Bcl-2、NF-κB、caspase-3和-9蛋白表達與細胞損傷、炎癥和細胞凋亡相關，在正常對照組相關蛋白表達較低(Fig.5,Fig.6和Fig.7)。經(jīng)過ISO腹腔注射導致急性心肌損傷可見上述蛋白在大鼠心肌組織中的表達明顯增加較對照組有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01)。經(jīng)過TA不同劑量預處理和VER預處理上述蛋白表達明顯下調(diào)，較ISO有明顯統(tǒng)計學意