長春西汀對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的SD大鼠心肌肥大的作用機制研究.pdf

1、心肌肥大多是高血壓性心臟病在病理學(xué)上表現(xiàn)，是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率和死亡率增加的一個獨立的危險因素，但其發(fā)展演變的具體機制尚不完全明確。心肌肥大是為了提供正常心搏出量的一種代償性反應(yīng)，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌肥大可以顯著改善患者的預(yù)后，因此，進一步研究心肌肥大發(fā)生的機制是非常必要的。
　　MAPK和PI3K-AKt介導(dǎo)的信號通路是心肌肥大形成過程中的重要信號通路。研究他們的表達將有助于揭示心肌肥大及其逆轉(zhuǎn)作用的機制。細胞內(nèi)鈉離子濃度在心肌肥大

2、和心力衰竭中起關(guān)鍵作用。在心肌肥大和心力衰竭模型中Na+流入的增加或Na+內(nèi)流轉(zhuǎn)運蛋白的上調(diào)，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈉離子濃度增加。鈉通道蛋白5型α亞基(SCN5A)、Na+/K+-ATP酶（NKA）三種亞型和Na+/H+交換蛋白1(NHE1)，都是關(guān)鍵的細胞內(nèi)鈉通道和轉(zhuǎn)運蛋白。
　　長春西汀具有電壓依賴性鈉通道抑制作用。長春西汀抑制大鼠的心肌細胞鈉電流，其抑制心肌細胞鈉電流的作用為劑量依賴性和電壓依賴性且可逆，對鈉通道的穩(wěn)態(tài)激活和失活過程的

3、影響，可使緩慢失活的鈉電流減少。其對心肌細胞鈉通道的抑制作用與河豚毒素（TTX）具有明顯相似性。有研究表明，河豚毒素能夠抑制心肌肥大。長春西汀是否也具有抑制心肌肥大的作用，有待進一步研究。長春西汀關(guān)于長春西汀對心血管系統(tǒng)的影響和治療作用研究較少，還沒有涉及心肌肥大的研究。
　　體外和體內(nèi)研究表明，應(yīng)用異丙腎上腺素（ISO）是常用的建立心肌肥大模型的方法。我們將以異丙腎上腺素誘導(dǎo)形成心肌細胞和整體動物心肌肥大模型為研究對象，運用分子

4、生物學(xué)、生物化學(xué)、形態(tài)學(xué)等技術(shù)，研究長春西汀是否能通過抑制MAPK和PI3K/Akt信號通路的激活抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大的發(fā)生發(fā)展，以及對細胞內(nèi)關(guān)鍵的鈉通道和轉(zhuǎn)運蛋白的表達和細胞內(nèi)鈉離子濃度的影響，觀察其對整體動物心肌肥大模型的作用。
　　第一部分：長春西汀對體外培養(yǎng)ISO誘導(dǎo)SD大鼠肥大心肌細胞的影響
　　目的：觀察長春西汀對體外培養(yǎng)異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的肥大心肌細胞的影響，探討磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K)

5、和MAPKs信號通路的調(diào)控作用；檢測心肌細胞內(nèi)鈉離子濃度和關(guān)鍵鈉通道及轉(zhuǎn)運蛋白的表達，探討其在心肌肥大調(diào)控中作用。
　　方法：體外培養(yǎng)原代心肌細胞，MTT法測定長春西汀對心肌細胞活性的影響，確定安全藥物濃度，心肌細胞經(jīng)過72小時培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基（不含血清、酚紅）處理，分成6個組：（1）對照組（Control group）：加等量的DMEM；（2）ISO組：異丙腎上腺素（10μmol/L）；（3）Vinp1組：ISO+Vinp（

6、5μmol/L）；（4） Vinp2組：ISO+Vinp（10μmol/L）；（5）Vinp3組：ISO+Vinp（20μmol/L）；（6） Vinp4組：ISO+Vinp（40μmol/L）。應(yīng)用藥物處理48小時后，測定細胞表面積，心肌細胞蛋白含量等細胞表型變化，應(yīng)用藥物處理6小時后，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測心肌細胞的ANP、BNP、PI3K、AKt mRNA水平，應(yīng)用蛋白印跡法檢測總的Akt和磷酸化Akt、總的ER

7、K和磷酸化ERK、總的JNK和磷酸化JNK、總的P38和磷酸化P38表達相對含量；檢測鈉通道蛋白5型α亞基(SCN5A)、Na+/K+-ATP酶（NKA）三種亞型（NKA-α1、NKA-α2、NKA-α3）、Na+/H+交換蛋白1(NHE1)的表達。使用共聚焦成像檢測載有鈉敏感性熒光染料CoroNa綠的心肌細胞中鈉離子濃度。
　　結(jié)果：（1）長春西汀濃度依賴性的降低肥大心肌細胞的心肌細胞表面積和總蛋白含量，抑制肥大心肌細胞ANP、

8、BNP mRNA的表達，改善PI3K、AKt mRNA表達，增加磷酸化AKt蛋白表達，減少磷酸化ERK、P38蛋白表達。（2）長春西汀抑制了ISO誘導(dǎo)的肥大心肌細胞內(nèi)鈉離子濃度的增加；ISO組和長春西汀組的心肌細胞中SCN5A的蛋白表達沒有顯著變化（P＞0.05），但是在心肌細胞中，ISO使NKA-α2和NKA-α3的蛋白表達顯著降低（兩者均為P＜0.05），但是NKA-α1不受影響（P＞0.05，ISO相對于對照組）。長春西汀明顯減弱

9、了ISO對NKA-α2和NKA-α3蛋白表達的抑制（P＞0.05，長春西汀組相對于ISO組）。與NKA-α2和NKA-α3的蛋白表達的減少相反，ISO使得NHE-1蛋白表達顯著增加，而且增加不受長春西汀的影響。
　　結(jié)論：長春西汀對ISO誘導(dǎo)的心肌肥大具有抑制作用。其可能機制為：通過影響PI3K-AKt和MAPK信號通路和鈉通道的阻斷作用。
　　第二部分：長春西汀對ISO誘導(dǎo)心肌肥大SD大鼠心肌重構(gòu)的影響
　　目的：研

10、究長春西汀對ISO誘導(dǎo)心肌肥大SD大鼠心肌重構(gòu)的影響。
　　方法：將55只成年雄性SD大鼠隨機分成4組：對照組10只、通過ISO誘導(dǎo)建立的大鼠心肌肥大模型組45只。將心肌肥大模型組大鼠隨機分為3組：單純心肌肥大模型組（ISO組）15只，治療組又分為：單純心肌肥大+長春西汀10 mg（Vinp I組）15只，單純心肌肥大+長春西汀20 mg（Vinp II組）15只。所有大鼠相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，成年雄性SD大鼠清醒狀態(tài)下每日分兩次（

11、上午10點、晚上8點各1次）經(jīng)背部皮下注射5 mg/kg/d異丙腎上腺素，共連續(xù)給藥4周。對照組大鼠相同方式給予2ml生理鹽水也分兩次（上午10點、晚上8點各1次）經(jīng)背部皮下注射。對照組大鼠和心肌肥大組同時給予每日2ml生理鹽水灌胃治療； Vinp I組和Vinp II組每日分兩次（上午10點、晚上8點各1次）經(jīng)背部皮下注射5mg/kg/d異丙腎上腺素同時，分別給予長春西汀10 mg/kg/d和20 mg/kg/d灌胃治療；處理4周后觀

12、察的主要指標有：各組動物尾動脈血壓（代替平均動脈壓作為衡量心臟后負荷的指標）、左心室質(zhì)量指數(shù)、心肌肥大細胞最短直徑和橫截面積、心肌間質(zhì)膠原容積分數(shù)以及心肌羥脯氨酸含量等各項心肌肥大指標。
　　結(jié)果：（1）長春西汀緩解ISO導(dǎo)致的大鼠尾動脈血壓下降。長春西汀抑制了ISO誘導(dǎo)的單純心肌肥大組左心室重量、左心室質(zhì)量指數(shù)的升高(P＜0.05)，差異具有顯著性。（2）長春西汀治療組與心肌肥大組大鼠相比，心肌細胞最短徑和心肌細胞橫斷面面積下降