脂肪酸延長(zhǎng)酶ELO家族與脂毒關(guān)系研究.pdf

1、當(dāng)長(zhǎng)鏈脂肪酸的積累超過(guò)脂肪組織的儲(chǔ)存能力，會(huì)在非脂肪組織過(guò)度沉積，造成脂毒，進(jìn)而引發(fā)脂毒性凋亡，是多種代謝性疾病的主要病因。脂肪酸延長(zhǎng)酶家族參與脂肪酸代謝流，且與膜脂的代謝密切相關(guān)。但脂肪酸延長(zhǎng)酶與脂毒關(guān)系并不清楚。酵母脂肪酸延長(zhǎng)酶ELO家族包括Elo1、Elo2、Elo3，其中Elo2和Elo3負(fù)責(zé)將長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)到極長(zhǎng)鏈脂肪酸，并參與細(xì)胞多項(xiàng)生命活動(dòng)和功能的調(diào)節(jié)，在真核生物中有很高的保守性，因此選擇酵母研究相關(guān)機(jī)制是很好的模型。

2、r>　　本文首先建立了油紅O比色快速檢測(cè)酵母中性脂含量的方法。利用油紅O比色法和薄層層析法分析野生型BY4741和脂肪酸延長(zhǎng)酶缺陷菌株脂質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)elo缺陷菌株中性脂含量積累。油酸處理后，胞內(nèi)中性脂含量升高。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析脂肪酸組成，結(jié)果顯示 ELO3敲除后，C26脂肪酸基本檢測(cè)不到，而 C20與 C22脂肪酸會(huì)累積；ELO2缺失后，C26脂肪酸的含量也明顯降低。而油酸的處理會(huì)增加BY4741胞內(nèi)總的極長(zhǎng)鏈脂肪酸的比例

3、。油酸處理后， elo2△和elo3△的不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例增大。
　　極長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶ELO2和ELO3缺陷后，細(xì)胞對(duì)油酸高度敏感。而ELO1突變株無(wú)油酸敏感表型。同時(shí)加入抗氧化劑VC或NAC，能有效補(bǔ)救油酸造成突變株的生長(zhǎng)抑制。利用 DCFH-DA檢測(cè)胞內(nèi)ROS水平，顯示油酸處理后elo2△和elo3△胞內(nèi)ROS含量積累。接下來(lái)對(duì)胞內(nèi)抗氧化酶活性及抗氧化劑含量的進(jìn)行測(cè)定，顯示油酸處理后野生型及elo1△胞內(nèi)抗氧化酶

4、活性升高，而elo2△和elo3△胞內(nèi)的CAT和SOD酶活性急劇降低；油酸處理后，還原型谷胱甘肽GSH含量均降低。通過(guò)對(duì)胞內(nèi)MDA及PCO含量的測(cè)定，顯示油酸處理后其含量均升高，表明油酸對(duì)酵母細(xì)胞造成了氧化損傷。尤其是elo2△和elo3△胞內(nèi)MDA含量的升高有極顯著性差異。elo2△和elo3△對(duì)兩性霉素 B等抗生素具有高度敏感性。對(duì)其麥角固醇含量的檢測(cè)，顯示含量低于野生型酵母菌株。利用 PI染色檢測(cè)細(xì)胞膜的通透性，發(fā)現(xiàn)elo2△和e

5、lo3△的膜通透性明顯高于野生型細(xì)胞，且油酸處理后膜通透性顯著提高。結(jié)果表明極長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶的缺失不僅引起細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成的變化，抗油酸誘導(dǎo)的氧化能力下降，同時(shí)還導(dǎo)致膜脂麥角固醇含量降低，細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降。
　　通過(guò)構(gòu)建elo3△背景的酵母必需基因超表達(dá)文庫(kù)，在高濃度油酸培養(yǎng)基上篩選抵抗油酸脅迫的菌株。經(jīng)過(guò)質(zhì)粒測(cè)序得到一系列油酸響應(yīng)基因，包括復(fù)制起始因子，參與復(fù)制修復(fù)、mRNA剪接的亞基，參與泛素化降解的ATP酶，及參與合成血紅