長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸鏈延長(zhǎng)酶與去飽和酶進(jìn)化分析及phytophthora infestans中相關(guān)基因鑒定.pdf

1、作為魚油主要成分的EPA和DHA等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(Long-ChainPolyUnsaturated fatty acids,LCPUFAs),是胎、嬰、幼兒的視網(wǎng)膜與大腦皮層正常發(fā)育所必需的,對(duì)防治心腦血管等疾病起重要作用。它們的保健功能已得到人們廣泛認(rèn)識(shí)。通常人體合成的EPA和DHA能夠滿足正常的生理活動(dòng)需要,但是孕婦、嬰幼兒、老年人和疾病患者需要飲食中補(bǔ)充部分EPA和DHA。目前,LCPUFA主要來源于海洋野生魚和單細(xì)胞微藻。

2、由于海洋野生魚資源日益枯竭,其產(chǎn)量已不能滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的需求,而且,由于環(huán)境污染等因?yàn)閷?dǎo)致這類魚油不適于孕婦和嬰幼兒食用,而通過單細(xì)胞微藻發(fā)酵途徑提煉魚油成本太高。因此尋找能夠持續(xù)、經(jīng)濟(jì)、安全的EPA和DHA生產(chǎn)替代來源成為亟待解決的問題。代謝基因工程技術(shù)的發(fā)展,為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在油料作物中生產(chǎn)LCPUFA提供了可能。最近,已從微藻中克隆、鑒定了一些LCPUFA合成過程中的鏈延長(zhǎng)酶和去飽和酶基因,并在油料作物中成功表達(dá),合成了EPA和

3、DHA,但合成水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于克隆這些基因的野生微藻。
　　 解決轉(zhuǎn)基因植物中LCPUFA合成水平低的方法除優(yōu)化基因表達(dá)、選擇合理的合成代謝途徑外,克隆超表達(dá)活性的基因顯然是最有效的途徑之一。
　　 但是,由于LCPUFA合成代謝過程中的鏈延長(zhǎng)酶和去飽和酶,除保守區(qū)的少數(shù)幾個(gè)氨基酸高度保守外,同源性很低,造成該類新基因克隆困難。目前,主要是通過cDNA文庫雜交篩選和規(guī)?；瘻y(cè)序相結(jié)合來篩選、克隆該類新基因,比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力,成本高

4、。
　　 近年來,公共生物信息數(shù)據(jù)庫中有關(guān)各種生物的核酸、蛋白序列信息已呈爆炸式增長(zhǎng),為分析和鑒定某類基因提供了強(qiáng)大的信息資源支持。本研究擬用已知功能的LCPUFA合成代謝途徑中的鏈延長(zhǎng)與去飽和酶氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行PSI-BLAST搜索,一方面系統(tǒng)搜索整理功能己鑒定或已預(yù)測(cè)的去飽和酶和鏈延長(zhǎng)酶；另一方面,對(duì)搜尋到的一些未知同源序列,通過生物信息學(xué)分析手段初步篩選、鑒定可能的去飽和酶和鏈延長(zhǎng)酶。在此基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建去飽和酶

5、和鏈延長(zhǎng)酶的進(jìn)化樹,繪制這些酶基因的生物詳細(xì)分布表,為克隆、鑒定該類新基因提供全面系統(tǒng)的參考指引。
　　 生物信息學(xué)分析結(jié)果如下:
　　 1、共從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到功能已鑒定的267個(gè)去飽和酶和243個(gè)鏈延長(zhǎng)酶,功能已預(yù)測(cè)未鑒定的107個(gè)去飽和酶和389個(gè)鏈延長(zhǎng)酶,同時(shí)新分析預(yù)測(cè)了近400個(gè)去飽和酶和鏈延長(zhǎng)酶類似基因。
　　 2、用neighbor-jioining法構(gòu)建了由532個(gè)去飽和酶構(gòu)成的無根進(jìn)化樹,

6、進(jìn)化樹共有6個(gè)骨干分枝,顯示去飽和酶在進(jìn)化早期就分化為6個(gè)不同亞家族。其中4個(gè)大亞家族分別為(1)First Desaturase、(2)Omega Desaturase、(3)Front-End Desaturase和(4)Sphingolipid Desaturase,與現(xiàn)有去飽和酶分類標(biāo)準(zhǔn)相符；另外一個(gè)是在進(jìn)化起源上很古老的亞家族,僅由來源于Phytophthora infestans中的3去飽和酶構(gòu)成,在進(jìn)化樹中位置獨(dú)特；還有一

7、個(gè)由來源于不同生物的11個(gè)去飽和酶構(gòu)成的小亞家族,后兩個(gè)小亞家族成員不適于現(xiàn)有去飽和酶分類標(biāo)準(zhǔn)分類。
　　 3、同樣方法構(gòu)建了由871個(gè)鏈延長(zhǎng)酶構(gòu)成的無根進(jìn)化樹,進(jìn)化樹共有2大支,顯示鏈延長(zhǎng)酶在進(jìn)化早期就分化為2個(gè)不同亞家族:(1)S/MUFA鏈延長(zhǎng)酶,(2)PUFA鏈延長(zhǎng)酶。2個(gè)亞家族間有1個(gè)共同保守的氨基酸框,意味著所有的鏈延長(zhǎng)酶可能起源相同,不同功能的分化可能是在進(jìn)化過程中適應(yīng)環(huán)境變化的結(jié)果。
　　 4、對(duì)去飽和酶

8、和鏈延長(zhǎng)酶進(jìn)化樹研究分析表明,去飽和酶和鏈延長(zhǎng)酶在功能進(jìn)化上至少是通過兩個(gè)時(shí)期來完成的。第一個(gè)時(shí)期,這些蛋白分化成不同的亞家族,其中去飽和酶分化成6個(gè)亞家族,而鏈延長(zhǎng)酶分化成2個(gè)亞家族,它們分別具有不同的底物特異性。第二個(gè)時(shí)期,每一個(gè)獨(dú)特的亞家族又發(fā)生了底物專一性和未知特異性的分化,使親緣關(guān)系很近的物種之間脂肪酸種類也出現(xiàn)了不同。即第一個(gè)時(shí)期限制了具有這些酶的功能范圍,第二個(gè)時(shí)期則是在這些范圍內(nèi)發(fā)生了不同功能的分化。
　　 5、

9、比較分析Phytophthora infestans中去飽和酶和鏈延長(zhǎng)酶進(jìn)化歷程發(fā)現(xiàn),去飽和酶在進(jìn)化起源上很古老,在去飽和酶進(jìn)化歷程中的第一次功能分化時(shí)期就已形成,而鏈延長(zhǎng)酶是在進(jìn)化歷程經(jīng)歷多次功能分化時(shí)期才形成的。表明來源于同一生物中同一代謝途徑中的兩種酶的進(jìn)化歷程可以不同。
　　 鑒于Phytophthora infestans中EPA合成途徑中的去飽和酶在進(jìn)化歷程中的獨(dú)特性,我們決定優(yōu)先對(duì)預(yù)測(cè)到的來源于Phytophtho

10、ra infestans中的3個(gè)去飽和酶和4個(gè)鏈延長(zhǎng)酶類似基因進(jìn)行克隆,并通過酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行功能鑒定。一方面是為了檢驗(yàn)我們生物信息學(xué)的分析結(jié)果,另一方面是為了克隆鑒定一些超標(biāo)達(dá)活性的去飽和酶和鏈延長(zhǎng)酶基因,提高轉(zhuǎn)基因油料作物中EPA和DHA的生產(chǎn)水平,結(jié)果如下:
　　 1、RT-PCR克隆到1個(gè)長(zhǎng)度為911bp的基因片段,序列分析表明是一個(gè)新的鏈延長(zhǎng)酶類似基因PinE4,在釀酒酵母中的表達(dá)產(chǎn)物,可將外源底物C18:2(△9,1

11、2)脂肪酸轉(zhuǎn)變成C20:2(△11,14)脂肪酸,表明其具有△9鏈延長(zhǎng)酶活性。
　　 2、RT-PCR克隆到1個(gè)長(zhǎng)度1013bp的基因片段,序列分析表明是一個(gè)含有2個(gè)內(nèi)含子的新鏈延長(zhǎng)酶類似基因PinE3,去內(nèi)含子后,獲得全長(zhǎng)741bp的編碼片段；同樣的方法分別克隆到另外2個(gè)新的類似鏈延長(zhǎng)酶基因PinE1(1022bp)和PinE2(1044 bp)及1個(gè)新的類似去飽和酶基因PinD1(1374bp)。
　　 本研究新預(yù)測(cè)