超長鏈多不飽和脂肪酸合成相關(guān)酶基因的克隆與鑒定及其在作物中的異源合成.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文超長鏈多不飽和脂肪酸合成相關(guān)酶基因的克隆與鑒定及其在作物中的異源合成姓名：孫全喜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：亓寶秀20110601超長鏈多不飽和脂肪酸合成相關(guān)酶基因的克隆與鑒定及其在作物中的異源合成2三個(gè)去飽和酶都具有一般去飽和酶所具備的三個(gè)組氨酸框結(jié)構(gòu)域，其中，PinD6和PinD5還具備frontend去飽和酶細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域。釀酒酵母功能鑒定實(shí)驗(yàn)表明：PinD6編碼的蛋白質(zhì)能夠?qū)営退幔↙

2、A，18:2Δ912）和亞麻酸（ALA，18:3Δ91215）分別轉(zhuǎn)化成γ亞麻酸（GLA，18:3Δ6912）和十八碳四烯酸（SDA，18:4Δ691215）；PinD5編碼的蛋白質(zhì)能夠?qū)⒍擀脕喡樗幔―GLA，20:3Δ81114）轉(zhuǎn)化成花生四烯酸（AA，20:4Δ581114）；PinD12編碼的蛋白質(zhì)能夠?qū)⒅舅?6:1Δ9和油酸（OA，18:1Δ9）分別轉(zhuǎn)化成16:2Δ912和亞油酸（LA，18:2Δ912），分別具有Δ6去飽和

3、酶、Δ5去飽和酶以及Δ12去飽和酶活性。并且這三個(gè)酶都具有很好的底物專一性。結(jié)合以前已經(jīng)克隆到的Δ17去飽和酶和Δ6鏈延長酶以及馬鈴薯致病疫霉脂肪酸的分布，我們推斷馬鈴薯致病疫霉中AA和EPA可能主要是通過ω6Δ6途徑來實(shí)現(xiàn)的。（3）強(qiáng)壯前溝藻中DHA合成相關(guān)基因的克隆我們對(duì)富含DHA（~12%）的強(qiáng)壯前溝藻的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序，分析并獲得了可能的去飽和酶基因EST序列4個(gè)和鏈延長酶基因的EST序列5個(gè)，并進(jìn)一步利用RACE的方法，獲得了

4、全部序列的3′端，以及編號(hào)為AcD20的一個(gè)特異的超長鏈多不飽和脂肪酸去飽和酶的全長序列，其功能正在檢測中。（4）多基因表達(dá)載體構(gòu)建方法的開發(fā)我們發(fā)明了一個(gè)新的多基因表達(dá)載體構(gòu)建的方法。該方法需要一個(gè)輔助載體，輔助載體具有XbaIMCSAvrIIXbaI的結(jié)構(gòu)，其中，XbaI和AvrII是同尾酶。目的片段分別克隆到輔助載體的多克隆位點(diǎn)MCS上。方法原理如下：將目的片段1、2、3…分別亞克隆到輔助載體中，得到含有（XbaI片段1AvrII

5、XbaI）、（XbaI片段2AvrIIXbaI）、（XbaI片段3AvrIIXbaI）…等一系列質(zhì)粒。由于XbaI和AvrII是同尾酶，二者酶切后可獲得相同的粘性末端。將片段2在質(zhì)粒（XbaI片段2AvrIIXbaI）中用XbaI切下，連接到經(jīng)AvrII線性化的質(zhì)粒（XbaI片段1AvrIIXbaI），鑒定方向后，獲得帶有目的片段1和2的質(zhì)粒（XbaI片段1AvrIIXbaI–片段2AvrIIXbaIAvrIIXbaI），而新形成的Av