高山被孢霉多不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因克隆及轉(zhuǎn)化甘藍型油菜研究.pdf

1、多不飽和脂肪酸是對人體有重要生理活性的物質(zhì)，有較高的藥用價值。利用油料作物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸是一種極具潛力的途徑，將不飽和脂肪酸生物合成途徑中的相關(guān)基因轉(zhuǎn)入植物生產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸成為近幾年油脂類國際會議的熱點。油菜是十字花科（Cruiferae）蕓薹屬（Brassica genus）植物，甘藍型油菜（Brassicanapus L.）在世界上是繼大豆和棕櫚之后的第三大油料作物，我國油菜種植面積和產(chǎn)量均占世界總量的30％左右，在農(nóng)業(yè)生

2、產(chǎn)和糧油安全上占有重要的戰(zhàn)略地位。本研究目的是從高山被孢霉中分離花生四烯酸（Arachidonic acid, AA）和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）合成途徑中的相關(guān)基因，并將其連接到帶有種子特異表達啟動子的植物表達載體上，通過農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化甘藍型油菜品種，從而在甘藍型油菜中構(gòu)筑AA和EPA 生物合成的途徑，為AA和EPA 來源開辟新的方向。本論文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 （1）克

3、隆了高山被孢霉的Δ6 去飽和酶基因、Δ6 延長酶基因和Δ5 去飽和酶基因，利用生物信息學手段分析了三個基因編碼的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，從推導的Δ6 去飽和酶基因和Δ5 去飽和酶基因編碼的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)均存在一個細胞色素b5 結(jié)構(gòu)域和3個組氨酸保守區(qū)I 區(qū)（HX3H）、II 區(qū)（HX2HH）和III 區(qū)（QIEHHLFP）；Δ6 延長酶基因編碼的氨基酸序列中，在183-188和221-225 氨基酸殘基位置分別有一個組氨酸的富集區(qū)和一個酪氨酸

4、的富集區(qū)，它們對基因功能的正常表達是必需的。實驗中對三個基因的進化也進行了分析。
　　 （2）把三個基因分別構(gòu)建酵母表達載體，分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母構(gòu)建重組基因工程菌，用于對三個基因的功能驗證。提取轉(zhuǎn)Δ6 去飽和酶基因重組畢赤酵母的總蛋白，SDS-PAGE 電泳后有目標蛋白條帶的出現(xiàn)，大小為51.8 kDa，證明Δ6 去飽和酶在酵母菌體內(nèi)能進行正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯，脂肪酸分析表明，Δ6 去飽和酶能把酵母自身能合成的LA 轉(zhuǎn)化為GLA，合成

5、的GLA 含量占總脂肪酸含量的6.3％，實驗中沒有檢測到OTA的生成，說明轉(zhuǎn)入酵母中的Δ6 去飽和酶基因不能利用ALA 合成新的產(chǎn)物或合成的產(chǎn)物量太少而不能檢測出來，據(jù)此推斷Δ6 去飽和酶基因?qū)A 底物具有偏好性。在添加GLA 底物時，Δ6 延長酶在重組酵母中能催化合成占總脂肪酸含量0.31％的DHGLA。添加底物DHGLA，轉(zhuǎn)入Δ5 去飽和酶基因的重組酵母脂肪酸中有2.85％的AA 生成。根據(jù)實驗結(jié)果推測Δ6 延長酶催化的反應(yīng)在多不

6、飽和脂肪酸合成中是限速步驟。
　　 （3）克隆了甘藍型油菜種子特異表達的napin 啟動子，通過napin 啟動子DNA序列分析，該啟動子富含AT堿基，含有3個TATA-box，7個CAAT-box，1個GATA-box，2個G-box和3個(CA)n-motif等調(diào)控元件，這些調(diào)控元件是高等植物啟動子序列的特征。采用酶切連接介導PCR的方法構(gòu)建Δ6 延長酶基因的表達框和Δ5 去飽和酶基因的表達框，利用napin 啟動子完成三價

7、植物表達載體pCAMBIA1303-D6ELD5(napin 啟動子)的構(gòu)建。
　　 （4）轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404后，通過愈傷組織轉(zhuǎn)化法、真空滲透法和蘸花法對甘藍型油菜7633 進行了轉(zhuǎn)化，其中愈傷組織轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率為1.2％，另外兩種轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化效率最高分別為1.8％和2.5％。利用Hyg對轉(zhuǎn)化的植株和種子進行篩選，獲得500多株轉(zhuǎn)基因油菜。對篩選到的陽性植株進行PCR 檢測和Southernblot分析，證明外源基