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文檔簡介
1、亞硝酸鹽型甲烷厭氧氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, N-DAMO)是一種新發(fā)現(xiàn)的生物反應(yīng),它偶聯(lián)了厭氧甲烷氧化與亞硝酸鹽還原,是連接全球碳素循環(huán)及氮素循環(huán)的獨(dú)特環(huán)節(jié)。催化N-DAMO反應(yīng)的微生物是隸屬于NC10門的Candidatus Methylomirabilis oxyfera(M.oxyfera)。
前期研究表明,N-DAMO菌富集過程中始終伴隨著異養(yǎng)反
2、硝化菌,兩者之間的關(guān)系非常復(fù)雜,存在競爭也存在互助,然而,這方面的研究卻未有報(bào)道。此外,N-DAMO研究的一個(gè)主要瓶頸是N-DAMO菌生長極其緩慢,其倍增時(shí)間長達(dá)14-25天,縮短富集周期迫在眉睫。已經(jīng)報(bào)道的所有N-DAMO接種物都取自淡水生境,近來,在海洋生境中也檢測到了N-DAMO菌的16S rRNA和pmoA基因序列,表明海洋生境中也存在N-DAMO菌,可能發(fā)生N-DAMO過程。本論文研究了淡水N-DAMO菌富集培養(yǎng)過程中N-DA
3、MO菌與異養(yǎng)反硝化菌的菌群演替規(guī)律,為獲得高純、高活性的N-DAMO富集培養(yǎng)物提供指導(dǎo);優(yōu)化了淡水富集培養(yǎng)基,探索了pH控制策略,提出了適合N-DAMO菌生長的最優(yōu)無機(jī)鹽組合及pH調(diào)控策略,縮短了N-DAMO菌的富集培養(yǎng)周期;富集培養(yǎng)了海洋N-DAMO菌,拓寬了N-DAMO菌的來源范圍。主要研究結(jié)果如下:
1.探明了淡水N-DAMO菌富集培養(yǎng)過程中N-DAMO菌與異養(yǎng)反硝化菌的菌群演替規(guī)律
?、僖赞r(nóng)田水稻土為接種物成功
4、獲得了淡水N-DAMO富集培養(yǎng)物。富集培養(yǎng)歷經(jīng)600天,呈現(xiàn)三個(gè)階段:菌體水解階段、活性遲滯階段和活性提高階段。從活性遲滯階段開始,N-DAMO反應(yīng)占主導(dǎo)地位。活性提高階段,N-DAMO菌的比活性呈指數(shù)增加,而異養(yǎng)反硝化菌的比活性僅小幅增加,后期甚至略有下降。在N-DAMO菌富集培養(yǎng)過程中,N-DAMO菌得到了定向富集,異養(yǎng)反硝化菌被逐漸取代。
②在接種物中發(fā)現(xiàn)了歸屬于NC10門的新類群即group E,其與M.oxyfera
5、親緣關(guān)系較遠(yuǎn),16SrRNA基因序列相似度低于90%。富集培養(yǎng)6個(gè)月后此類細(xì)菌消失,僅富集得到了歸屬于group A的NC10門細(xì)菌。
2.提出了適合N-DAMO菌生長的最優(yōu)無機(jī)鹽組合及pH調(diào)控策略
①采用正交試驗(yàn)及酸堿滴定試驗(yàn),優(yōu)化研究了目前普遍采用的培養(yǎng)基中四種無機(jī)鹽組分(CaCl2、 MgSO4、KH2PO4和KHCO3),獲得了適合N-DAMO菌生長的最優(yōu)無機(jī)鹽組合:0.3gL-1 CaCl2、0.2gL-1
6、MgSO4、0.3gL-1KH2PO4和0.2gL-1 KHCO3。
?、谔岢隽丝刂芅-DAMO培養(yǎng)基pH為中性的策略,培養(yǎng)基中KHCO3的濃度為0.2gL-1時(shí),用含有1% CO2的混合氣體(1% CO2,99% Ar)對培養(yǎng)基曝氣,可方便有效地維持N-DAMO菌生長所需的中性環(huán)境。
3.獲得了海洋N-DAMO富集培養(yǎng)物并探索了富集培養(yǎng)物特性
①以近岸沉積物為接種物成功獲得了首個(gè)海洋N-DAMO富集培養(yǎng)物。
7、富集培養(yǎng)期間,N-DAMO菌的比活性和數(shù)量均呈指數(shù)增長。海洋N-DAMO菌的倍增時(shí)間為33.6-38.4天,長于淡水N-DAMO菌的倍增時(shí)間(14-25天)。海洋N-DAMO菌的比細(xì)胞活性為0.15±0.07fmolCH4d-1cell-1,與淡水N-DAMO菌的比細(xì)胞活性(0.09-0.34fmolCH4d-1cell-1)相當(dāng)。
?、谔矫髁烁患囵B(yǎng)過程中N-DAMO菌的群落結(jié)構(gòu)特征。與淡水N-DAMO富集培養(yǎng)過程類似,盡管在
8、接種物中檢測到了歸屬于group E的NC10門細(xì)菌,富集16個(gè)月后,僅得到歸屬于group A的NC10門細(xì)菌。表明歸屬于group A的NC10門細(xì)菌具有N-DAMO功能。
?、厶剿髁嘶|(zhì)(甲烷和亞硝酸鹽)及鹽度對海洋N-DAMO富集培養(yǎng)物的影響。海洋N-DAMO菌對甲烷和亞硝酸鹽的表觀親和力常數(shù)均低于淡水N-DAMO菌對甲烷和亞硝酸鹽的表觀親和力常數(shù)。此外,鹽度對海洋N-DAMO富集培養(yǎng)物影響較大,適合海洋N-DAMO菌生
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