熒光氧氣納米傳感器的構(gòu)建及在腫瘤細胞線粒體功能障礙評估中的應(yīng)用.pdf

1、氧含量的檢測在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域有著非常重要的意義，熒光氧氣納米傳感器常被用于檢測細胞或組織的溶氧量。線粒體是有氧呼吸的主要場所，其代謝損傷會導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生，基于溶氧量的檢測可表征線粒體的呼吸速率，進而評估腫瘤細胞線粒體的功能狀態(tài)。然而，當(dāng)前的傳感器主要針對細胞外或者細胞內(nèi)的溶解氧檢測，難以精確測定線粒體內(nèi)的氧含量變化。本論文主要研究生物兼容高靈敏度熒光氧氣納米傳感器的構(gòu)建，并通過對線粒體呼吸速率的熒光檢測，評估腫瘤細胞線粒體功能

2、障礙。
　　本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1、利用再沉淀-包覆法制備摻雜氧氣熒光探針分子和參比物質(zhì)的比率熒光氧氣納米傳感器，通過多聚賴氨酸大分子(PLL)的表面修飾使納米傳感器具有較低的毒性和有效的細胞攝取率。首先以PMMA和BTD為基質(zhì)將疏水性的氧氣探針分子PtOEP和熒光參比分子C6封裝到納米顆粒內(nèi)，隨后利用納米顆粒表面硅醇的負電性和PLL分子的正電性之間的靜電吸引，制備PLL包覆的PtOEP/C6摻雜的PMMA

3、基質(zhì)熒光氧氣納米傳感器。該熒光氧氣納米傳感器的氧氣猝滅率為77％，可通過非線性Stern-Volmer公式進行擬合，由于PLL的修飾使其具有良好的生物相容性和較高的細胞攝取率。在此基礎(chǔ)上，我們利用PS代替PMMA，并且將可以進行能量傳遞的熒光團DNM與PtOEP、C6同時封裝到PS基質(zhì)納米顆粒內(nèi)，制備了PLL包覆的PtOEP/DNM/C6摻雜的PS基質(zhì)熒光氧氣納米傳感器。該納米傳感器的氧氣猝滅率達到94％，其比率熒光與溶氧量之間具有良好

4、的線性關(guān)系，并且可以被細胞有效吞噬，在細胞內(nèi)呈現(xiàn)良好的比率熒光成像。
　　2、通過碳二亞胺反應(yīng)在PLL包覆氧氣納米傳感器表面修飾親脂性陽離子TPP，實現(xiàn)了對細胞線粒體的靶向定位。首先研究了PLL包覆納米顆粒的自組裝形成機理，認為采用10 mg/L的MH-PLL(Mw=30-70 kDa)包覆制成的納米顆粒具有最佳的形貌、大小和zeta電勢。基于zeta電勢方法和熒光胺方法對納米顆粒進行分析，發(fā)現(xiàn)PLL殼層中存在三種類型的氨基基團，

5、分別位于殼層的內(nèi)部、中部和表面，其中表面氨基濃度為12 nmol/mL。通過碳二亞胺反應(yīng)將TPP基團偶聯(lián)到納米顆粒表面，利用核磁共振和吸收光譜分析證明TPP偶聯(lián)修飾得到實現(xiàn)。對TPP偶聯(lián)納米顆粒進行共聚焦顯微鏡成像和斷層掃描成像，證明其可以被細胞有效攝取，并成功地靶向細胞線粒體。
　　3、制備了三類分別靶向細胞外、細胞內(nèi)和線粒體內(nèi)的熒光氧氣納米傳感器，基于時間分辨熒光方法檢測肝癌細胞HepG2和正常肝細胞LO2的呼吸效率，評估腫瘤

6、細胞線粒體的功能障礙。三類靶向性氧氣納米傳感器具有相同的核心基質(zhì)（包括PS、DTS、C6和氧氣探針PtTFPP），但表面殼層卻各不相同，Si-NPs具有帶負電的二氧化硅表面，PLL-NPs表面是帶正電的PLL殼層，TPP-NPs表面偶聯(lián)TPP基團。通過共聚焦顯微鏡和細胞超薄切片透射電子顯微鏡成像證明Si-NPs、 PLL-NPs和TPP-NPs分別靶向細胞外、細胞內(nèi)和線粒體。對負載三類納米傳感器的細胞在不同溶氧量環(huán)境中的熒光壽命進行檢測