線粒體功能障礙在慢性腎功能衰竭腎小管間質(zhì)纖維化中的作用及干預(yù)研究.pdf

1、線粒體是真核細(xì)胞中含有核外遺傳物質(zhì)的一類細(xì)胞器，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝，是真核細(xì)胞賴以生存的基礎(chǔ)。線粒體主要功能有：合成機(jī)體所需的大部分三磷酸腺苷；氧化并清除細(xì)胞內(nèi)過多的脂肪酸，同時阻斷非酯化脂肪酸進(jìn)入循環(huán)血液；鈣穩(wěn)態(tài)的維持，同時調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與死亡途徑。線粒體進(jìn)行生命活動過程中能夠生成活性氧(ROS)，生理?xiàng)l件下，ROS很快被體內(nèi)的抗氧化酶所清除，從而能夠維持ROS生成與被清除的平衡，當(dāng)線粒體ROS產(chǎn)生異常增多或抗氧化能力下降，氧化應(yīng)激

2、就會產(chǎn)生。線粒體源性的氧化應(yīng)激亦可以引起內(nèi)皮細(xì)胞線粒體滲透性轉(zhuǎn)變孔道的開放介導(dǎo)釋放炎癥因子，炎性反應(yīng)的發(fā)生亦會破壞機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。線粒體功能障礙導(dǎo)致的ATP合成減少、氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等因素相互協(xié)同，影響，作用于多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前，業(yè)已證實(shí)線粒體功能障礙與神經(jīng)退行性變，糖尿病，衰老等密切相關(guān)。慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是各類腎臟疾病終末期的共同表現(xiàn)，是以腎單位進(jìn)行性損壞造成腎臟的排泄系統(tǒng)、

3、代謝內(nèi)分泌功能紊亂的一組臨床癥候群，預(yù)后欠佳[12]。目前，CRF的治療主要為保護(hù)殘余腎單位，因此，尋找有效可靠的治療新靶點(diǎn)進(jìn)行綜合治療有利于CRF的防控。線粒體發(fā)生功能障礙時ATP的合成量減少，氧自由基大量生成，炎癥因子釋放增多，這些因素大部分均伴隨于CRF的發(fā)生、發(fā)展，并最終促使CRF向ESRD轉(zhuǎn)化[13]。此外，腎小管間質(zhì)纖維化是CRF發(fā)生、發(fā)展至ESRD期的共同通路，腎小管間質(zhì)纖維化與CRF嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此，我們設(shè)想線粒體

4、功能障礙參與了CRF的腎小管間質(zhì)纖維化，阻斷線粒體功能障礙能夠減輕CRF腎小管間質(zhì)纖維化及癥狀，并延緩CRF進(jìn)展。線粒體功能障礙一般都伴隨有炎癥反應(yīng)的增加[21]，而炎癥反應(yīng)在初始階段通常被認(rèn)為是機(jī)體的適應(yīng)性反應(yīng)，持續(xù)性炎癥反應(yīng)易造成機(jī)體的損傷。相對于特異性免疫反應(yīng)（T、B細(xì)胞），天然免疫是機(jī)體抵抗病原微生物侵襲的第一道防線，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。天然免疫可以通過胞膜和胞漿的模式識別受體(PRR)識別各種感染性及非感染性的刺激。核

5、苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族(NOD)樣受體家族包含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NLRP3)是PRR大家族中NOD成員之一，在活化后可以招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(CARD，ASC)及半胱天冬酶-1前體形成一個大分子蛋白復(fù)合物“NLRP3炎癥小體”，其使半胱天冬酶-1(caspase-1)活化，進(jìn)而裂解IL-1β前體和IL-18前體，最終導(dǎo)致IL-1β和IL-18等促炎因子的產(chǎn)生與分泌，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。線粒體功能障礙與CRF通常都伴隨有持

6、續(xù)加重的炎癥反應(yīng)，NLRP3炎癥小體的活化導(dǎo)致的IL-1β和IL-18的大量釋放已經(jīng)被證實(shí)與腎臟疾病相關(guān)，本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦提示NLRP3炎癥小體基因敲除能夠抑制線粒體功能障礙并緩解白蛋白所誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞(PTC)損傷。NLRP3炎癥小體亦參與了UUO模型的發(fā)病、發(fā)展，而UUO模型典型的腎臟病理改變即是腎小管間質(zhì)纖維化，腎纖維化幾乎伴隨著CRF的整個發(fā)展階段。因此，我們設(shè)想下調(diào)NLRP3炎癥小體能夠通過阻斷線粒體功能障礙從而減

7、輕CRF腎小管間質(zhì)纖維化及癥狀。本研究分為三個部分：
　　第一部分：線粒體功能障礙在慢性腎功能衰竭腎小管間質(zhì)纖維化中的作用。
　　目的：探討線粒體功能障礙在CRF腎小管間質(zhì)纖維化中的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠PTC，應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激，抗氧化劑錳苯甲酸卟啉(Manganese(Ⅲ)5，10，15，20-tetrakis(4-benzo

8、ic acid) porphyrin，MnTBAP）預(yù)處理小鼠PTC，分為正常組、TGF-β1組、MnTBAP+ TGF-β1組。體內(nèi)通過5/6腎切除術(shù)構(gòu)建小鼠CRF模型，此外，應(yīng)用MnTBAP腹腔注射小鼠，隨機(jī)分為4組:正常組、5/6腎切組、MnTBAP組、MnTBAP+5/6腎切組。應(yīng)用real-time聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和western blot法檢測E-cadherin、V

9、imentin、α-平滑肌激動蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、NLRP3、PPARγ的表達(dá);應(yīng)用電鏡檢測小鼠PTC內(nèi)線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化;熒光探針DCHFDA染料結(jié)合流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平; JC-1染色激光共聚焦并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測定PTC線粒體膜電位;應(yīng)用real-time PCR測定mtDNA的拷貝數(shù);酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELIS

10、A)法檢測尿蛋白/肌酐比值以及血尿素氮、肌酐、血紅蛋白(hemoglobin，Hb); BP2000無創(chuàng)血壓儀檢測鼠尾動脈血壓;脾臟稱重;Masson染色;real-time PCR和western blot檢測腎皮質(zhì)Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ的表達(dá);
　　結(jié)果：⑴TGF-β1呈時間依賴性抑制小鼠PTC E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)Vimentin、α-SMA的表達(dá)。⑵TGF-β1呈濃度

11、依賴性的促進(jìn)小鼠PTC ROS產(chǎn)生，以時間依賴性的降低線粒體膜電位、mtDNA拷貝數(shù)。電鏡觀察正常組小鼠PTC線粒體形態(tài)規(guī)則飽滿，線粒體嵴排列整齊清晰。TGF-β1呈時間依賴性誘導(dǎo)小鼠PTC線粒體形態(tài)腫脹加大，嵴模糊不清甚至消失。⑶5/6腎臟切除小鼠2周尿蛋白/肌酐比值開始顯著增高，8周尾動脈血壓明顯增高，12周脾臟重量明顯增加，Hb顯著下降，血清尿素氮，肌酐顯著增高，Masson染色提示小管間質(zhì)纖維化明顯，腎組織PTC線粒體形態(tài)腫脹，

12、嵴模糊不清甚至消失。腎皮質(zhì)mtDNA拷貝數(shù)顯著下降，腎皮質(zhì)NLRP3 mRNA顯著增高，PPARγmRNA顯著下降。⑷MnTBAP抑制TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠PTC ROS生成，逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位和mtDNA拷貝數(shù)下降，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，抑制Vimentin、α-SMA表達(dá)。⑸MnTBAP+5/6腎切組與5/6腎切組相比，腎小管間質(zhì)纖維化顯著好轉(zhuǎn)，腎皮質(zhì)Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)和

13、mRNA相對量明顯減少，血清肌酐、尿素氮、脾臟重量、血壓下降、尿蛋白/肌酐比值下降，Hb上升。此外，MnTBAP+5/6腎切組較5/6腎切組，腎組織PTC線粒體超微結(jié)構(gòu)改善;mtDNA拷貝數(shù)明顯增多。
　　結(jié)論：線粒體功能障礙參與了CRF腎小管間質(zhì)纖維化及癥狀，阻斷線粒體功能障礙能夠減輕CRF腎小管間質(zhì)纖維化及癥狀。
　　第二部分：PPARγ可減輕慢性腎功能衰竭線粒體功能障礙和腎小管間質(zhì)纖維化。
　　目的：觀察PPAR

14、γ對CRF線粒體功能障礙和腎小管間質(zhì)纖維化的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠PTC，瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3-h PPARγ質(zhì)粒，分為四組:正常組、空載(Vehicle，Vehi)組、TGF-β1刺激組、PPARγ過表達(dá)+TGF-β1刺激組。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過5/6腎切除構(gòu)建CRF小鼠模型，隨機(jī)分為四組:正常組、5/6腎切除組、羅格列酮灌胃組、5/6腎切除+羅格列酮灌胃組。采用real-time PCR以及western blot方法檢測E-

15、cadherin、α-SMA、Vimentin的表達(dá);電鏡檢測腎組織內(nèi)PTC線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化;熒光探針DCHFDA染料法測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平;JC-1染色激光共聚焦并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測定線粒體膜電位;應(yīng)用real-time PCR法測定mtDNA的拷貝數(shù);ELISA法檢測尿蛋白/肌酐比值以及血尿素氮、肌酐、Hb;BP2000無創(chuàng)血壓儀檢測鼠尾動脈血壓;脾臟稱重;Masson染色;real-time PCR和western blot檢測

16、腎皮質(zhì)Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴PPARγ阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠PTC ROS生成，逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位和mtDNA拷貝數(shù)下降，改善線粒體超微結(jié)構(gòu)、上調(diào)E-cadherin表達(dá)，抑制Vimentin、α-SMA表達(dá)。⑵5/6腎切+羅格列酮灌胃組與5/6腎切組相比，腎小管間質(zhì)纖維化組顯著好轉(zhuǎn)，腎皮質(zhì)Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ蛋白表達(dá)

17、和mRNA相對量明顯減少，血清肌酐、尿素氮、脾臟重量、血壓下降、尿蛋白/肌酐比值下降，Hb上升。此外，5/6腎切+羅格列酮灌胃組較5/6腎切組，腎組織PTC線粒體超微結(jié)構(gòu)改善;mtDNA拷貝數(shù)明顯增多。
　　結(jié)論：PPARγ可以減輕CRF腎小管間質(zhì)纖維化及癥狀，這可能與抑制線粒體功能障礙有關(guān)。
　　第三部分：下調(diào)NLRP3可減輕慢性腎功能衰竭線粒體功能障礙和腎小管間質(zhì)纖維化。
　　目的：觀察下調(diào)NLRP3對CRF線粒體

18、功能障礙和腎小管間質(zhì)纖維化的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠PTC，瞬時轉(zhuǎn)染NLRP3小干擾RNA(small interferingRNA,SiRNA)，分為四組:正常組、Vehi組、TGF-β1刺激組、NLRP3-/-+TGF-β1刺激組。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過5/6腎切除構(gòu)建CRF小鼠模型，隨機(jī)分為四組:正常組、5/6腎切除組、NLRP3-/-組、5/6腎切除+NLRP3-/-組。應(yīng)用real-time PCR和westernblot法

19、檢測E-cadherin、Vimentin、α-SMA的表達(dá);電鏡檢測小鼠PTC內(nèi)線粒體形態(tài)的改變;采用熒光探針DCHFDA染料檢測細(xì)胞內(nèi)ROS生成情況;JC-1染色激光共聚焦結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位;real-time PCR檢測mtDNA拷貝數(shù)。ELISA法檢測尿蛋白/肌酐比值以及血尿素氮、肌酐、Hb; BP2000無創(chuàng)血壓儀檢測鼠尾動脈血壓;脾臟稱重;Masson染色;real-time PCR和western blot檢測

20、腎皮質(zhì)Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴下調(diào)NLRP3能阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠PTC ROS生成，逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位和mtDNA拷貝數(shù)下降，改善線粒體超微結(jié)構(gòu)、上調(diào)E-cadherin表達(dá)，抑制Vimentin、α-SMA表達(dá)。⑵5/6腎切+NLRP3-/-組與5/6腎切組相比，腎小管間質(zhì)纖維化組顯著好轉(zhuǎn)，腎皮質(zhì)Fibronectin、Collagen-Ⅰ、Collagen-