DDAH2-ADMA通路在高糖誘導內(nèi)皮祖細胞線粒體功能障礙中的作用及機制.pdf

1、研究背景:糖尿病血管病變是糖尿病致殘致死最主要的原因之一，包括大血管病變（如高血壓和動脈粥樣硬化等）與微血管病變（如糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病等）。血管內(nèi)皮功能障礙和血管生成能力受損是導致糖尿病血管病變的重要因素。內(nèi)皮祖細胞(Endothelialprogenitor cells，EPCs)是一類能循環(huán)、增殖并分化為成熟內(nèi)皮細胞的前體細胞，其主要功能是修復內(nèi)皮并促進血管新生。臨床及動物實驗顯示糖尿病時，循環(huán)EPCs減少、血管形成能力減

2、弱，提示EPCs功能改變可能在糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年研究顯示，線粒體功能障礙與糖尿病及糖尿病血管并發(fā)癥密切相關。1型及2型糖尿病動物和患者伴有骨骼肌、肝臟、心臟、視網(wǎng)膜微血管和脂肪組織中線粒體氧化磷酸化活性下降，ATP生成減少，線粒體功能障礙。因此，調(diào)節(jié)線粒體功能可能是治療糖尿病及血管并發(fā)癥的重要藥物靶點。EPCs線粒體功能障礙是否與糖尿病及血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展有關，目前尚未見報道。電壓依賴性陰離子通道(voltage

3、dependentanion channel，VDAC)是維持線粒體功能必不可少的通道蛋白，通過不同的結(jié)構(gòu)或功能狀態(tài)調(diào)節(jié)著線粒體內(nèi)外的能量、離子及代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運。研究表明，在1型、2型糖尿病動物以及糖尿病微血管病變動物，VDAC1表達均顯著上調(diào)?；贓PCs在維持血管功能和促進血管修復中起重要作用、外周循環(huán)EPCs數(shù)目與糖尿病外周血管病變程度呈負相關，同時鑒于線粒體功能調(diào)節(jié)的關鍵蛋白VDAC1在糖尿病動物模型的高表達，本研究將在培養(yǎng)的E

4、PCs，探討高糖對EPCs線粒體功能的影響及其與VDAC1的關系，為闡明糖尿病及血管病變的發(fā)病機制提供新的實驗證據(jù)。此外，我室和國內(nèi)外研究表明，內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物非對稱二甲基精氨酸（asymmetricdimethylarginine，ADMA）升高在胰島素抵抗、糖尿病以及糖尿病血管并發(fā)癥中起重要作用。ADMA在體內(nèi)主要經(jīng)二甲基精氨酸-二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，D

5、DAH）代謝。ADMA不僅可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管形成，與鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠循環(huán)中EPCs數(shù)目下降和功能受損有關，且外源性ADMA能濃度依賴性促進EPCs的衰老，抑制其增殖和血管形成。新近研究報道，在1型和2型糖尿病大鼠，肝臟和心肌線粒體功能障礙與內(nèi)源性ADMA濃度升高密切相關，并且外源性ADMA可直接引起大鼠肝細胞線粒體功能障礙，提示ADMA可能通過干擾EPCs線粒體功能，促進糖尿病及其血管并發(fā)癥的發(fā)生

6、發(fā)展。因此，本課題將在培養(yǎng)的大鼠EPCs，研究高糖對EPCs線粒體功能的影響，觀察外源性ADMA是否可模擬高糖的損傷作用，并進一步探討ADMA引起EPCs線粒體功能障礙是否涉及VDAC1途徑。
　　方法:為了探討高糖對EPCs線粒體功能的影響，葡萄糖(10、20或30 mmol/L)處理EPCs12、24或48小時，30 mmol/L甘露醇作為等滲對照組;為了觀察DDAH/ADMA通路是否可模擬高糖誘導EPCs線粒體功能障礙的作用

7、，外源性給予ADMA（3、10或30μmol/L）12、24或48小時;為了進一步探討VDAC1在ADMA誘導EPCs線粒體功能障礙中的作用，預先用VDAC1抑制劑4，4'-二異硫氰酰-2，2'-基二磺酸二鈉鹽(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'dsulfonicacid，DIDS)(2，10，50μmol/L)孵育EPCs1小時后，再加入30μmol/L ADMA處理12小時。
　　密度梯度離心

8、加選擇性粘附分離正常大鼠骨髓EPCs，培養(yǎng)7天后acLDL/UEA-1雙熒光染色鑒定;流式法檢測線粒體膜電位，螢火蟲熒光素酶法檢測線粒體ATP生成;Hoechst法檢測EPCs凋亡;Real-time PCR法檢測DDAH1 mRNA、DDAH2 mRNA和VDAC1mRNA表達;細胞免疫熒光法鑒定VDAC1在EPCs的表達及定位;Western Blot法檢測VDAC1蛋白表達;HPLC法檢測細胞上清ADMA水平，熒光探針DCFH-D

9、A法檢測細胞內(nèi)活性氧。
　　結(jié)果:高糖能濃度依賴性地抑制EPCs線粒體ATP生成，促進EPCs凋亡;高糖可顯著增加細胞上清液ADMA水平，下調(diào)DDAH2mRNA表達，并上調(diào)VDAC1 mRNA和蛋白表達，但對DDAH1 mRNA表達無影響;甘露醇等滲組對EPCs功能沒有影響。
　　外源性ADMA能顯著上調(diào)VDAC1 mRNA和蛋白表達，增加細胞內(nèi)活性氧生成，降低線粒體膜電位，抑制ATP生成，促進EPCs凋亡;VDAC抑制劑D