DDAH2過表達(dá)改善糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能不全及高糖對DDAH-ADMA-NOS-NO通路損害.pdf

1、研究背景和目的糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病,糖尿病易并發(fā)動脈粥樣硬化等血管并發(fā)癥,現(xiàn)已成為糖尿病病人死亡主要原因。一氧化氮(NO)介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)降低不僅是糖尿病血管并發(fā)癥的早期標(biāo)志,而且在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。大量研究證明,內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物一非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能不全的重要物質(zhì)。內(nèi)源性ADMA主要通過二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)代謝消除,因此DDA

2、H活性是決定體內(nèi)ADMA含量的關(guān)鍵因素。己知DDAH存在兩種亞型-DDAH1和。DDAH2;雖然兩種亞型均存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞,但前者主要分布于表達(dá)神經(jīng)型NOS的組織,后者則主要分布于表達(dá)內(nèi)皮型NOS的心血管組織。有研究表明,當(dāng)血管壁DDAH活性下降時,DDAH1的表達(dá)并沒有明顯改變,由此提示:在內(nèi)皮細(xì)胞的ADMA代謝中,DDAH2較DDAH1可能起著更為重要的作用。因此,本課題擬在鏈佐星誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型和高糖孵育培養(yǎng)的ECV304細(xì)

3、胞:觀察高糖血癥對血管組織、細(xì)胞DDAH/ADMA/NOS/NO通路的損害;探討體外DDAH2基因轉(zhuǎn)移能否增加DDAH活性,降低內(nèi)源性ADMA含量,逆轉(zhuǎn)糖尿病血管內(nèi)皮依賴性舒張功能不全和高糖對細(xì)胞NO合成的損害;并比較研究抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)能否保護(hù)DDAH活性、逆轉(zhuǎn)高糖血癥對DDAH/ADMA/NOS/NO通路的損害;從而闡明DDAH2在糖尿病血管并發(fā)癥形成過程中的重要作用。為其臨床防治及藥物開發(fā)拓開新的思路,為

4、糖尿病血管內(nèi)皮功能不全的基因治療提供可靠的實(shí)驗依據(jù)。 方法①給雄性SD大鼠(體重210±10g)一次性腹腔注射鏈佐星(STZ 60 mg/kg)制備糖尿病大鼠模型,治療組大鼠在糖尿病模型成立后從飲水中給予PDTC(10m/kg/d)治療8周,檢測正常對照組、糖尿病組、糖尿病+PDTC治療組和PDTC對照組大鼠血糖、血脂水平及胸主動脈形態(tài)改變,同時檢測血管組織DDAH2表達(dá)及DDAH活性、血清ADMA含量和離體胸主動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性

5、舒張反應(yīng)。②用重組hDDAt{2腺病毒(1.5×10<'10>virus/ml)體外轉(zhuǎn)染正常大鼠和糖尿病大鼠的胸主動脈環(huán),并檢測血管組織DDAH2表達(dá)、DDAH活性以及血管環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能，觀察DDAH2過表達(dá)能否改善糖尿病大鼠的血管內(nèi)皮功能不全。③分別用30mmol／L葡萄糖孵育正常ECV304細(xì)胞、轉(zhuǎn)DDAH2基因的ECV304(pcDNA3.1-DDAH2)、轉(zhuǎn)空載體的ECV304細(xì)胞(pcDNA3.1)72 h。檢測細(xì)胞DD

6、AH1和DDAH2表達(dá)、DDAH和NOS活性以及培基中ADMA和NO含量，觀察DDAH2過表達(dá)是否能逆 轉(zhuǎn)高糖對細(xì)胞中DDAH／ADOS／NO通路的損害。 結(jié)果 ①糖尿病大鼠血糖和血脂明顯升高，而血管組織DDAH活性明顯降低(0.052±0.003 vs 0.098±0.010 U／g pro，P<0.01 vs Con)，并伴隨著血中ADMA濃度顯著升高(2.18±0.23 vs 1.14±0.12，μmol／L，P<0.0

7、1 vs Con)和胸主動脈內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低(52±2.3％vs 94±1.8％，P<0.01 vs Con)，半數(shù)有效濃度(EC<,50>)升高(239.64±20.00 vs 88.38±8.79nmol／L， P<0.Olvs Con)，表明血管內(nèi)皮功能受損?？寡趸瘎㏄DTC治療8周后，不僅降低血糖，而且保護(hù)血管DDAH活性，阻止內(nèi)源性ADMA升高，改善糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能不全。②用重組hDDAH2腺病毒體外轉(zhuǎn)

8、染糖尿病大鼠的離體胸主動脈環(huán)后，經(jīng)RT-PCR可檢測到人的DDAH2 mRNA在血管組織表達(dá)，其DDAH活性明顯高于未轉(zhuǎn)染組和AdSCMVβ-gal腺病毒轉(zhuǎn)染對照組(0.220±0.020 vs 0.057±0.006 vs 0.055±0.008U／g pro，all P<0.01)，并改 善轉(zhuǎn)染血管環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，表現(xiàn)為血管環(huán)對乙酰膽堿誘導(dǎo)的最大舒張反應(yīng)較未轉(zhuǎn)染的糖尿病大鼠血管環(huán)顯著升高(85±1.7％ vs 54±1.2

9、％，P<0.01，P<0.01 vs untransfected diabetic aortas)，EC<,50>降低(119.46±6.76 vs 248.74_±10.67 nmol／L，P<0.01 vs untransfected diabetic aortas)。而用相同滴度的重組Ad5CMVβ-gal腺病毒轉(zhuǎn)染糖尿病組大鼠胸主動脈環(huán)，卻不能改善其內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙。用同樣滴度的重組hDDAH2腺病毒感染正常對照組大鼠的胸

10、主動脈環(huán)，雖然血管環(huán)對乙酰膽堿的最大舒張反應(yīng)沒有改變，但對低濃度的乙酰膽堿反應(yīng)性更加敏感，即ECS0明顯降低，(76.68±8.17 vsl32.68±20.029 nmol／L，P<0.05 vs untransfected control aortas)。說明腺病毒介導(dǎo)的hDDAH2基因體外轉(zhuǎn)染能夠增加DDAH活性，逆轉(zhuǎn)糖尿病血管內(nèi)皮不全。③用30mmol／L葡萄糖孵育細(xì)胞72 h后，DDAH2表達(dá)明顯降低，但DDAHl表達(dá)無明顯改

11、變，細(xì)胞DDAH活性也降低(0.37±0.03 vs 0.71±0.03 U／g pro,P<0.01 vs Con)，培基中ADMA含量升高，細(xì)胞NOS活性亦降低，導(dǎo)致N0生成減少(35.83±3.07 vs 54.98±1.51，P<0.01 vs Con)。DDAH2 過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)高糖對細(xì)胞DDAH／ADMA／NOS／NO通路的損害。 結(jié)論①本研究首次將重組hDDAH2腺病毒導(dǎo)入糖尿病大鼠的離體血管，不僅能夠上調(diào)血管組織

12、中DDAH2表達(dá)和DDAH活性，而且能逆轉(zhuǎn)糖尿病血管的內(nèi)皮依賴性舒張功能不全；②抗氧化劑PDTC能夠保護(hù)糖尿病大鼠血管DDAH活性，降低內(nèi)源性ADMA蓄積，改善糖尿病血管內(nèi)皮功能不全；③本研究還揭示高糖降低ECV304細(xì)胞DDAH活性、增加ADMA蓄積、抑制NOS活性及NO生成是通過降低DDAH2表達(dá)，而非DDAH1；并首次研究發(fā)現(xiàn)DDAH2過表可逆轉(zhuǎn)高糖對細(xì)胞DDAH／ADMA／NOS／NO通路的這些損害作用，證明在內(nèi)皮細(xì)胞中。DDA