利用人工microRNA技術(shù)構(gòu)建CHSJ基因沉默載體及適于矮牽牛轉(zhuǎn)化株系的篩選.pdf

1、矮牽牛具有易于組培、植株再生容易、生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、易于管理、花期長(zhǎng)、對(duì)環(huán)境要求不嚴(yán)格等優(yōu)點(diǎn)。因此，矮牽牛不但是重要的觀賞花卉，同時(shí)在基因研究中發(fā)揮重要的作用。在植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，基因型是影響遺傳轉(zhuǎn)化效果的重要因素。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建矮牽牛CHSJ(X14599基因)基因沉默植物表達(dá)載體，并在對(duì)其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過(guò)程中，對(duì)矮牽牛株系進(jìn)行篩選，選出適于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的株系。且對(duì)篩選出的株系，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化。結(jié)果如下：
　　 1.利用人工

2、miRNA技術(shù)，構(gòu)建矮牽牛CHSJ(X14599基因)基因沉默植物表達(dá)載體pCMF604。
　　 2.種子在氯氣中消毒4h，獲得種子發(fā)芽率最高且污染率最低；在獲得無(wú)菌苗的過(guò)程中，把氯氣消毒種子與升汞消毒的外植體和種子相比較發(fā)現(xiàn)：氯氣消毒種子發(fā)芽所需時(shí)間較短，且操作簡(jiǎn)單。對(duì)無(wú)菌苗進(jìn)行再生率的優(yōu)化之前對(duì)無(wú)菌苗進(jìn)行農(nóng)藝性狀的觀察篩選出26個(gè)株系。對(duì)26個(gè)株系再生率同對(duì)照A01相比較，得到再生率較高于對(duì)照A01的株系：C01、C02、C

3、03、C04、C05和C06。
　　 3.對(duì)C01、C02、C03、C04、C05和C06六個(gè)株系，農(nóng)桿菌侵染后進(jìn)行染色率和染色點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)，于對(duì)照A01比較得出了染色率較高的株系C01、C04和C06。
　　 4.對(duì)C01、C04和C06三個(gè)株系進(jìn)行轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，結(jié)果表明：共培養(yǎng)2-3d、菌液濃度OD600=0.3-0.4、侵染時(shí)間5-10min和在侵染液中加入AS時(shí)會(huì)達(dá)到最佳的侵染效果，并對(duì)pCMF604侵染獲得抗性愈