30214.利用人工設(shè)計(jì)反式作用小rna進(jìn)行細(xì)菌基因沉默的研究

1、中國海洋大學(xué)博士學(xué)位論文利用人工設(shè)計(jì)反式作用小RNA進(jìn)行細(xì)菌基因沉默的研究姓名：程汝濱申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：藥物化學(xué)指導(dǎo)教師：于文功20090601突變體實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，atsRNA的二級結(jié)構(gòu)(如靶基因配對結(jié)合區(qū)域的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、配對區(qū)域內(nèi)loop環(huán)內(nèi)堿基個(gè)數(shù)等)和穩(wěn)定性對atsRNA的干擾活性至關(guān)重要；(二)在構(gòu)成atsRNA的三個(gè)模塊結(jié)構(gòu)中，靶基因配對結(jié)合區(qū)域和Hfq結(jié)合位點(diǎn)是atsRNA發(fā)揮基因沉默作用所必須的，且Hfq結(jié)合位點(diǎn)對于a

2、tsRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性非常重要。(三)利用hfq缺失菌株，我們發(fā)現(xiàn)atsRNA介導(dǎo)的基因沉默是Hfq依賴型的，且Hfq能夠與atsRNA直接結(jié)合而增加其穩(wěn)定性。(四)atsRNA能夠直接抑制靶基因的翻譯和降解靶mRNA，atsRNA介導(dǎo)的靶mRNA的降解是RNaseE依賴型的；并且在atsRNA介導(dǎo)的基因沉默中，atsRNA對靶基因翻譯的阻斷作用起主導(dǎo)作用，而靶mRNA的降解不是atsRNA引起靶基因沉默所必須的。(五)為了進(jìn)一步證明

3、atsRNA能夠作為一種細(xì)菌基因功能研究的工具，我們針對細(xì)菌體內(nèi)的必須基因murA，trmA和耀徊設(shè)計(jì)合成了一系列的atsRNA，定量PCR的結(jié)果表明atsRNA明顯的降低了靶基因的mRNA表達(dá)水平，且atsRNA的表達(dá)能夠有效地抑制宿主細(xì)胞的生長速度，說明atsRNA的表達(dá)有效的降低了靶基因的表達(dá)。綜上所述，本論文首次利用人工設(shè)計(jì)的反式作用小RNA成功地對細(xì)菌的靶基因進(jìn)行了高效和特異性的沉默，從而建立了一種高效、簡便的細(xì)菌功能基因的研

4、究技術(shù)。隨著細(xì)菌內(nèi)源性小RNA的研究進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)小RNA在細(xì)菌的致病力和環(huán)境適應(yīng)力方面發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。針對細(xì)菌的致病基因或致病基因的調(diào)控基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的atsRNA，將有可能阻斷或抑制細(xì)菌的致病力，達(dá)到抗感染的目的。因此，atsRNA基因沉默技術(shù)的建立不但具有重要的理論意義，而且具有廣泛的應(yīng)用前景，將為細(xì)菌感染的治療提供了一種嶄新的途徑，同時(shí)為解決日益加劇的細(xì)菌耐藥難題創(chuàng)造條件。關(guān)鍵詞：人工設(shè)計(jì)反式作用小RNA；基因沉默；細(xì)菌；非