Rac、Cdc42信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的單分子探針構(gòu)建與熒光光譜檢測(cè).pdf

1、Rho GTPases包括RhoA、Rac1和Cdc42等，作為分子開(kāi)關(guān)，接受胞外刺激信號(hào)后，從聯(lián)結(jié)GDP的失活狀態(tài)，轉(zhuǎn)為聯(lián)結(jié)GTP的激活狀態(tài)，與其下游效應(yīng)分子相互作用，啟動(dòng)一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、遷移，細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)錄激活等許多重要的生理過(guò)程，可直接影響某些疾病的產(chǎn)生，如腫瘤的發(fā)生，轉(zhuǎn)移等。FRET對(duì)于熒光基團(tuán)的相對(duì)距離(小于10nm)和空間取向高度敏感，通過(guò)FRET效率的測(cè)量，觀察生物大分子間相互作用

2、的改變情況，從而研究其構(gòu)象變化與相互作用。更重要的是，采用這種技術(shù)，無(wú)需破碎細(xì)胞或?qū)?xì)胞造成損傷，可在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下，實(shí)時(shí)、定量地對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白-蛋白間，如配基與受體，信號(hào)分子與效應(yīng)分子的相互作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。 本文以PCR方法從人腦cDNA基因文庫(kù)內(nèi)擴(kuò)增了Rac1、Cdc42cDNA基因全序列，及其效應(yīng)蛋白基因Pak1、N-WASP的GTP酶聯(lián)結(jié)區(qū)域(GBD)序列，從dsRedl-N1質(zhì)粒中擴(kuò)增dsRed1紅色熒光蛋白全基因序

3、列。將上述基因定向克隆至pECFP-N1質(zhì)粒載體，獲得包含dsRed1，Pak1或N-WASP的GBD，Rac1或Cdc42，ECFP的基于FRET原理的胞質(zhì)表達(dá)單分子探針，在此基礎(chǔ)上，在dsRed1的C末端加入一段CAAM法尼基化基序，構(gòu)建包含EGFP，Pak1的GBD，Rac或Cdc42，dsRed1-CAAM的質(zhì)膜特異表達(dá)的單分子探針。離體熒光光譜檢測(cè)表明，在轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生了FRET現(xiàn)象。誘導(dǎo)5min的活細(xì)胞中，F(xiàn)RET效率最