miR-29a在膿毒癥中靶向STAT3促進(jìn)單核細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、背景
　　膿毒癥為機(jī)體感染所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其英縮寫為SIRS，膿毒癥患者處于發(fā)病期間，其全身各種組織器官共同參與這一過(guò)程。這種疾病在致使重癥監(jiān)護(hù)室患者死亡方面排在全球的首位，嚴(yán)重威脅患者生命健康，同時(shí)亦給社會(huì)和家庭帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)壓力，同時(shí)生物機(jī)體的免疫反應(yīng)亦在該過(guò)程中扮演著重要角色。在膿毒癥發(fā)生時(shí)，機(jī)體同時(shí)存在免疫抗擊以及免疫抑制，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。除此之外，抗炎以及促炎反應(yīng)亦參與了膿毒癥的發(fā)生。膿毒癥發(fā)生的臨床表

2、現(xiàn)往往呈現(xiàn)出多樣性，即沒(méi)有其標(biāo)志性的臨床表現(xiàn)，因此越來(lái)越多的研究者將目光轉(zhuǎn)移到尋找膿毒癥特異性生物學(xué)標(biāo)志物的研究上來(lái)，以期將之應(yīng)用于膿毒癥的臨床診斷、治療以及預(yù)后評(píng)價(jià)中。迄今為止，已有多種膿毒癥相關(guān)分子標(biāo)志物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其中包括與凝血和炎癥反應(yīng)相關(guān)的分子標(biāo)志物，如C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、降鈣素原等，目前這些分子標(biāo)志物已有部分被應(yīng)用于臨床。但在目前所使用的上述分子標(biāo)志物中均存在敏感性過(guò)高以及特異性不強(qiáng)等

3、缺點(diǎn)，因此應(yīng)用于診斷膿毒癥往往結(jié)果并不理想;評(píng)分系統(tǒng)雖然能夠用于對(duì)膿毒癥患者的預(yù)后情況以及病情的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，但卻不能應(yīng)用于膿毒癥的診斷，同時(shí)亦不能夠應(yīng)用于膿毒癥的治療當(dāng)中。所以尋找新的膿毒癥診斷、治療以及判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物成為目前醫(yī)學(xué)界亟待解決的問(wèn)題。
　　miRNA為一類非編碼小RNA分子，成熟miRNA的長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸，通過(guò)生物機(jī)體可以快速識(shí)別特定目標(biāo)的mRNA，全面調(diào)控mRNA的降解，還可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控其翻譯過(guò)

4、程。生物機(jī)體中miRNA與一系列生命活動(dòng)過(guò)程相關(guān)，其中包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生以及機(jī)體免疫等。目前已有大量研究證實(shí)，miRNA與膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。miR-29為一類miRNA，在人體的肺、腎臟、心臟等組織細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)。miR-29a為miR-29家族中的重要成員之一，其在生物機(jī)體一系列生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但目前尚未有miR-29a與膿毒癥發(fā)生和發(fā)展相關(guān)性的研究。
　　STATs，即以激

5、活因子為中心，進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄，屬于由酪氨酸蛋白激酶活化的轉(zhuǎn)錄因子，存在于細(xì)胞漿中，具有介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)性以及增生性信號(hào)的功能。JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要成員包括JAKs以及STATs蛋白家族。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，STATs蛋白家族為JAKs的底物，STAT能夠通過(guò)促進(jìn)炎癥介質(zhì)的表達(dá)從而影響膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展。STATs蛋白家族能夠通過(guò)介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，從而調(diào)控生物機(jī)體中一系列生理過(guò)程，其中包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖以及凋亡

6、等。STAT3為STATs家族的重要成員之一，在生物機(jī)體中STAT3相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與多種生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程之間存在密切聯(lián)系，從而參與了一系列生理和病理過(guò)程。STAT3能夠通過(guò)調(diào)控相應(yīng)靶基因，以便加速細(xì)胞增殖、有效組織細(xì)胞凋亡的速度，改善細(xì)胞惡變的現(xiàn)象。不同的JAK/STAT信號(hào)通路在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中往往會(huì)具有不同作用，其中JAK2/STAT3通路在膿毒癥引起的多器官功能障礙的發(fā)展過(guò)程中扮演著十分重要的角色。

7、通過(guò)人為手段阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路能夠進(jìn)而阻斷膿毒癥發(fā)生過(guò)程中引起的過(guò)激炎癥反應(yīng)，此外還能同時(shí)抑制機(jī)體過(guò)度抗炎反應(yīng)的發(fā)生，最終發(fā)揮保護(hù)組織器官的功能。
　　目的
　　本研究擬通過(guò)檢測(cè)miR-29a在膿毒癥患者外周血白細(xì)胞中的表達(dá)，探討其與膿毒癥患者預(yù)后以及血清中炎性因子的相關(guān)性，同時(shí)分析miR-29a表達(dá)的改變對(duì)LI-10誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞系THP-1增殖、凋亡以及細(xì)胞周期的影響;除此之外，我們還利用生物信息學(xué)

8、軟件對(duì)miR-29a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并進(jìn)行驗(yàn)證。本研究旨在旨在為了解miR-29a在膿毒癥發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，同時(shí)為膿毒癥的臨床診斷，進(jìn)行靶向治療給予強(qiáng)大的后援。
　　方法
　　(1)選取2015年8月至次年8月期間于XXX醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室(intensive careunit, ICU)收治的膿毒癥患者外周血樣本為對(duì)象，共40例;采集同期于XXX醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)收治的SIRS患者外周血樣本，共35例;同時(shí)采集

9、10例同期于XXX醫(yī)院門診進(jìn)行健康檢查的健康志愿者外周血樣本，共10例。熒光定量PCR檢測(cè)上述血液樣本中mIR-29a的表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)血清中IL-10和TNF-α的含量。分析miR-29a與IL-10、TNF-α的相關(guān)性。
　　(2) ELISA法檢測(cè)不同患者來(lái)源的單核細(xì)胞以及用20 ng/mL LPS作用后的THP-1細(xì)胞中IL-10蛋白的表達(dá)情況。設(shè)計(jì)并合成miR-29a inhibitor，將之轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞

10、用以抑制細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)。熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)量。用20 ng/mL LPS作用于轉(zhuǎn)染后的THP-1細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。
　　(3)將LPS(20 ng/ml)和LPS+ IL-10(10 ng/mL)分別作用于THP-1細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率;western blot法檢測(cè)細(xì)胞中STAT3和p-STAT

11、3蛋白的表達(dá)。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-29a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。分別構(gòu)建STAT33'UTR WT（野生型）和STAT33'UTR Mut（突變型）質(zhì)粒載體并將之分別與miR-29a mimic共轉(zhuǎn)染HTP-1細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。將miR-29amimic分別轉(zhuǎn)染來(lái)自于健康志愿者外周血的單核細(xì)胞以及培養(yǎng)的人單核細(xì)胞THP-1，采用熒光定量PCR和western blot法分別檢測(cè)上述細(xì)胞中STAT3 mRNA和蛋白

12、的表達(dá)。將miR-29a和/或STAT3慢病毒載體轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，隨后用20 ng/ml LPS作用于上述細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡率，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。
　　結(jié)果
　　(1)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組患者血漿中miR-29a的相對(duì)表達(dá)量為0.235±0.110、膿毒癥組患者為0.733±0.126、SIRS組患者為0.419±0.093。與對(duì)照組相比，膿毒癥組患者血漿中miR-29a的表達(dá)水平

13、明顯增高(t=3.122，P=0.035＜0.05);與對(duì)照組相比，SIRS組患者血漿中miR-29a的表達(dá)水平明顯增高(t=2.091，P=0.044＜0.05);與SIRS組患者相比，膿毒癥組患者血漿中miR-29a的表達(dá)水平明顯增高(t=2.322，P=0.046＜0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組患者血清中IL-10的表達(dá)量為（233.175±25.624）pg/mL、膿毒癥組患者為(549.367±30.098)pg/

14、mL、SIRS組患者為（331.119±29.033）pg/mL。與對(duì)照組相比，膿毒癥組患者血清中IL-10的表達(dá)水平明顯增高(t=4.355，P=0.029＜0.05);與對(duì)照組相比，SIRS組患者血清中IL-10的表達(dá)水平明顯增高(t=3.761，P=0.041＜0.05);與SIRS組患者相比，膿毒癥組患者血清中IL-10的表達(dá)水平明顯增高(t=2.716，P=0.043＜0.05)。對(duì)照組患者血清中TNF-α的表達(dá)量為（189.

15、233±19.259）pg/mL、膿毒癥組患者為（411.189±24.106）pg/mL、SIRS組患者為（290.611±22.735）pg/mL。與對(duì)照組相比，膿毒癥組患者血清中TNF-α的表達(dá)水平明顯增高(t=6.811，P=0.023＜0.05);與對(duì)照組相比，SIRS組患者血清中TNF-α的表達(dá)水平明顯增高(t=4.655，P=0.038＜0.05);與SIRS組患者相比，膿毒癥組患者血清中TNF-α的表達(dá)水平明顯增高(t=

16、4.316，P=0.044＜0.05)。miR-29a與IL-10呈正相關(guān)(r=0.407，P=0.041＜0.05);對(duì)膿毒癥患者外周血中miR-29a的表達(dá)與TNF-α含量之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明miR-29a與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.576，P=0.038＜0.05)。
　　ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，各膿毒癥患者單核細(xì)胞中IL-10的表達(dá)量均明顯增高(P＜0.05)。采用ELISA法對(duì)用20 ng

17、/mL LPS作用后THP-1細(xì)胞在0、4、8、12h時(shí)IL-10的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明隨著時(shí)間的推移，LPS作用后人單核細(xì)胞THP-1中IL-10的表達(dá)水平逐漸增高。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與control組相比，miR-29a inhibitor組細(xì)胞含有miR-29a表達(dá)能力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P＜0.05)，已經(jīng)順利建立了THP-1細(xì)胞，可以對(duì)miR-29a起到表達(dá)抑制的效果。經(jīng)過(guò)MTT法可以發(fā)現(xiàn)，較之于照組顯而言，THP-

18、1細(xì)胞經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor以后，其分別于48 h、72 h、96 h的組織率得到很大的提升(P＜0.05)。Hoechst染色法檢測(cè)結(jié)果表明，miR-29a inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組組(P＜0.01)。
　　(2)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和IL-10作用組細(xì)胞中細(xì)胞的存活率均逐漸增高;其中相較于對(duì)照組，IL-10處理組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的存活率明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，IL-1

19、0作用組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)。隨著時(shí)間的推移，STAT3和p-STAT3蛋白的表達(dá)水平逐漸增高。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，STAT3為miR-29a的靶基因。與對(duì)照組相比，miR-29a mimic與STAT33'UTR WT共轉(zhuǎn)染組已經(jīng)在不斷降低其熒光素酶表達(dá)量(P＜0.05);與對(duì)照組對(duì)比，miR-29a mimic與STAT33'UTR Mut共轉(zhuǎn)染組，兩者的熒光素酶表達(dá)量基本不變(P＞0.05)。
　　在分

20、離自健康志愿者外周血的單核細(xì)胞中，當(dāng)miR-29a表達(dá)上調(diào)后能夠明顯抑制細(xì)胞中STAT3 mRN和蛋白的表達(dá)(P＜0.05);在培養(yǎng)的人單核細(xì)胞THP-1中，當(dāng)miR-29a表達(dá)上調(diào)后能夠明顯抑制細(xì)胞中STAT3 mRN和蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。與miR-control組相比，miR-29a組細(xì)胞的凋亡率明顯增高(P＜0.05);而miR-control+STAT3組細(xì)胞的凋亡率則明顯降低(P＜0.05);而miR-29a+STAT

21、3組細(xì)胞的凋亡率與miR-control組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。miR-29a組在1、3、4、5天時(shí)細(xì)胞的存活率明顯低于miR-control組(P＜0.05); miR-control+STAT3組細(xì)胞的存活率明顯高于miR-control組(P＜0.05);而miR-29a+STAT3組與miR-control組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　miR-29a在膿毒癥患者外周血中呈高表達(dá)狀態(tài)，其能