miR-29a靶向調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HMGN3基因表達(dá)研究.pdf

1、MiRNA是一種大小約21～23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，定位于RNA前體的3'端或者5'端，參與調(diào)控基因表達(dá)，從而廣泛地參與細(xì)胞生物學(xué)過程，包括發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)體外增殖和分化均受miRNAs調(diào)控。MSCs是來源于中胚層的成體干細(xì)胞，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富。MSCs具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能。本

2、實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-29a/b參與體外MSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化調(diào)控，同時(shí)通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測與細(xì)胞周期調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的MYCN、HMGN3、MAFB和PTP4A1是miR-29的靶基因。
　　本文通過在MSCs中高表達(dá)miR-29a，檢測PTP4A1、HMGN3、MAFB和MYCN的表達(dá)改變，進(jìn)一步利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-29a與靶基因的直接靶向作用，并進(jìn)一步證明miR-29a可通過靶向上述基因從而參

3、與MSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化調(diào)控。
　　目的：
　　研究miR-29a對骨髓MSCs的神經(jīng)分化和增殖調(diào)控的靶基因。
　　方法：
　　1.大鼠骨髓MSCs的體外分離和培養(yǎng)。分離SD大鼠雙側(cè)股骨和脛骨骨髓，培養(yǎng)大鼠的MSCs至第三代。
　　2.慢病毒介導(dǎo)miR-29a前體在MSCs中表達(dá)。
　　3.實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測MYCN、HMGN3、PTP4A1和MYAB基因表達(dá)的mRNA表達(dá)。

4、>　　4.免疫印跡法(western blot，WB)檢測HMGN3的蛋白表達(dá)。
　　5.雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-29a靶向HMGN3。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)值用樣本均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異，以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1.體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增骨髓MSCs
　　體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs

5、，采用反復(fù)貼壁純化方法，當(dāng)傳至第三代時(shí)，細(xì)胞純化超過99％，滿足實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.慢病毒介導(dǎo)miR-29a在MSCs中高表達(dá)
　　用制備好的病毒上清感染P3MSCs，4d后EGFP熒光到達(dá)高峰，MSCs細(xì)胞維持梭形、克隆樣增生。miR-29a表達(dá)量在miR-29a感染組中顯著增高(＞4倍)。
　　3.miR-29a高表達(dá)抑制MYCN和HMGN3在MSCs中的表達(dá)
　　檢測miR-29a預(yù)測靶基因MYCN、HMG

6、N3、PTP4A1和MYAB的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示在四種基因中，MYCN和HMGN3的表達(dá)在miR-29a高表達(dá)的MSCs中顯著降低。免疫印跡法顯示HMGN3蛋白表達(dá)同時(shí)降低。
　　4.miR-29a直接靶向HMGN3
　　利用pmirGLO載體多克隆位點(diǎn)，成功將HMGN33'UTR基因結(jié)合區(qū)克隆到Nhe1和Sal1酶切位點(diǎn)。
　　利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將HMGN3-pmirGLO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入PC12細(xì)胞，48h后再用慢病

7、毒介導(dǎo)miR-29a前體在PC12細(xì)胞中高表達(dá)，感染48h后80％以上PC12細(xì)胞被成功感染并顯示EGFP綠色熒光，qRT-PCR檢測miR-29a表達(dá)增高約5倍。
　　雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示miR-29a可顯著降低熒光素酶顯色，證明miR-29a可直接靶向HMGN33'UTR區(qū)并抑制其表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　miR-29a靶向并抑制HMGN3在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)，提示其可能參與MSCs向神經(jīng)細(xì)胞的分化調(diào)