DREB 1A多克隆抗體制備以及青霉菌干菌絲體抗病機(jī)理Northern檢測.pdf

1、植物轉(zhuǎn)錄因子脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(dehydration responsive element binding protein，縮寫為DREB)在干旱、高鹽及低溫脅迫信號傳遞中起重要作用，它能與脫水應(yīng)答元件(dehydration responsive element，縮寫為DRE)特異結(jié)合、在低溫、干旱、高鹽脅迫條件下調(diào)控與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關(guān)的功能基因的表達(dá)。因此利用轉(zhuǎn)錄因子來改良植物抗逆性，能獲得較為理想的綜合效果?，F(xiàn)已從

2、擬南芥中克隆及鑒定的DREB有兩類，它們分別命名為：DREB 1A、DREB 1B、DREB 1C的DREB 2A、DREB 2B(LIU Qiang et.aL.2000)。試驗中所用的DREB 1ACDNA事實上是由擬南芥DREB 1A的mRNA反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄合成的cDNA。試驗以表達(dá)載體pCAMBIA 1301/DREB 1A為模板，通過PCR擴(kuò)增編碼DREB 1A轉(zhuǎn)錄因子的基因。用PCR擴(kuò)增的目的片段和表達(dá)表達(dá)載體pGEX-4T-1

3、構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-4T-1/DREB 1A。先用構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)克隆菌株DH 10 B，挑選陽性克隆進(jìn)行菌落PCR、瓊脂糖凝膠電泳、酶切以及靶基因測序等一系列驗證后，再用經(jīng)測序驗證的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)表達(dá)菌株BL 21(DE3)。小量表達(dá)融合蛋白，SDS-PAGE分析表明融合蛋白的表達(dá)量占菌體蛋白的50％以上，且以包涵體的形式存在。大量表達(dá)融合蛋白，純化包涵體，切割融合蛋白，

4、SDS-PAGE回收目的蛋白條帶，以目的條帶為抗原免疫兔子制備DREB 1A轉(zhuǎn)錄因子的多克隆抗體，ELISA檢測結(jié)果表明所制備的多克隆抗體的效價達(dá)到25，600稀釋倍數(shù)，可用于含編碼DREB 1A轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)基因植物后代的西部印跡(Western blot)。 青霉菌[Penicillium chrysogenum(PEN)]干菌絲體[Dry mycelium(DM)]是一種制藥產(chǎn)業(yè)廢物，當(dāng)作為一種有機(jī)肥料用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)時，研

5、究發(fā)現(xiàn)青霉菌干菌絲體能有效控制幾種土傳真菌疾病，如用5％和7％的PEN浸出液極大地提高棉花幼苗對鐮刀霉[Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum(fov)]和黃萎病[Verticillium dahliae Kleb (Vd)]的抗性，但其作用的方式至今仍未清楚(Suiyun et al，2006)。實驗用青霉菌干菌絲體的5％(W/V)水浸出液澆灌子葉剛剛完全展開的棉花和西瓜幼苗，處理時間分別為4h、6h

6、、8h、10h、12h、24h，對照用蒸餾水澆灌，提取處理和對照的棉花和西瓜子葉總RNA，用八種編碼病程相關(guān)蛋白即PR-1a，PR-1b，PR-2，PR-3，PR-4，PR-5，PR—A和PR—B的cDNA片段作為探針，通過Northern印跡和放射自顯影技術(shù)來檢測相應(yīng)病程相關(guān)蛋白基因其轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄水平，以便從轉(zhuǎn)錄水平來解釋青霉菌干菌絲體的抗菌機(jī)理。實驗結(jié)果表明：青霉菌干菌絲體的水浸出液除對編碼PR-4和PR-5轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響