赤魟（Dasyatis akajei）白細(xì)胞介素8（Interleukin-8）的功能研究與進(jìn)化分析.pdf

1、以我國(guó)南海海洋生物軟骨魚(yú)赤魟作為研究對(duì)象，綜合應(yīng)用基因工程、蛋白純化等分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物信息等功能基因組研究方法和技術(shù)手段進(jìn)行研究。在實(shí)驗(yàn)室已克隆的赤魟白細(xì)胞介素8(IL-8)基因序列的基礎(chǔ)上，對(duì)趨化因子家族重要成員的IL-8進(jìn)行進(jìn)化與功能的分析和研究，并且制備了多克隆抗體，為利用免疫學(xué)方法進(jìn)一步研究提供了必需的輔助材料。以期開(kāi)發(fā)軟骨魚(yú)赤魟的分子生物學(xué)資源，并在闡明IL-8基因在魚(yú)類(lèi)中的生理活性機(jī)制基礎(chǔ)上，為其潛在應(yīng)用價(jià)值提供

2、直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。 氨基酸序列分析表明，赤魟IL-8具有保守的四個(gè)半胱氨酸(Cys)，且N端為CXC，屬于CXC型趨化因子。和其它已報(bào)導(dǎo)的魚(yú)類(lèi)IL-8一樣，赤缸IL-8缺乏經(jīng)典的ELR motif，并且與人、鼠等哺乳類(lèi)的IL-8氨基酸序列同源性較低。不同于哺乳動(dòng)物中IL-8序列的高度保守，已報(bào)道的魚(yú)類(lèi)中的IL-8序列相似性也較低，這可能跟魚(yú)類(lèi)中IL-8 正在高速進(jìn)化有關(guān)。 選取赤魟IL-8的成熟肽構(gòu)建了硫氧還蛋白(TR

3、X)融合表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了原核表達(dá)。以0.2mM IPTG做誘導(dǎo)劑25℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)12小時(shí)，成功獲得了可溶的重組融合蛋白rTRX-IL8。采用Ni<'2+>螯和親和層析和G25分子篩等純化步驟獲得到了較高純度的重組IL-8成熟蛋白。HPLC分析純化后的重組IL-8蛋白純度在80～90﹪之間。 制備了多克隆抗體，Western blotting結(jié)果顯示純化后的抗體特異性良好，Dotblotting檢測(cè)

4、抗體效價(jià)達(dá)到了1:50，000。為利用免疫學(xué)方法進(jìn)一步研究IL-8基因，及其表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)、功能以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及抑制腫瘤遷移的可能作用機(jī)制等提供了必需的輔助材料。對(duì)赤魟重組IL-8的生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。赤魟重組IL-8對(duì)豚鼠中性粒細(xì)胞的體外趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其確實(shí)具有中性粒細(xì)胞趨化功能，并且這種趨化作用呈濃度依賴(lài)性。赤魟的IL-8雖然缺乏ELR motif，依然具有趨化中性粒細(xì)胞的功能，讓我們聯(lián)想到魚(yú)類(lèi)中IL-8趨化功能的行使可能與E