辛香料活性成分綠原酸和辣椒堿的納米脂質(zhì)給藥系統(tǒng)研究.pdf

1、從辛香料中攫取具有高度活性的有效成分用于疾病的預防與治療是現(xiàn)代新藥研發(fā)的重要方向和新途徑。但因辛香料活性成分性質(zhì)各異，其穩(wěn)定性、溶解度、刺激性、生物利用度等問題的解決是擴展其臨床應用的重要瓶頸。利用現(xiàn)代藥劑學先進的藥物傳遞技術、載體技術及納米技術，能夠有效的改善藥物傳遞中的關鍵問題。本文分別選用水溶性和難溶性的辛香料活性成分綠原酸及辣椒堿，在嘗試解決其穩(wěn)定性、溶解度、刺激性、生物利用度等問題的過程中，引入了脂質(zhì)體技術、前藥自組裝納米技術

2、及其聯(lián)用技術，探索了多種納米制劑技術在實現(xiàn)辛香料活性成分高效傳遞中的關鍵科學問題，為不同類型辛香料活性成分的開發(fā)應用提供新的策略，為實現(xiàn)辛香料活性成分的臨床應用提供新方法與新載體。
　　第一章辛香料活性成分及其納米脂質(zhì)體制劑研究進展
　　對辛香料活性成分的藥理作用及其納米脂質(zhì)體制劑研究進展進行了綜述，總結了辛香料藥理活性，明確辛香料作為藥食同源的藥物開發(fā)價值。對納米脂質(zhì)體制劑的研究進展進行了綜述，立足于解決不同性質(zhì)的辛香料活

3、性成分開發(fā)所遇到的各種難點問題。同時，提出本論文的設計思路與構想，為本論文實驗的順利開展提供了理論基礎。
　　第二章綠原酸納米脂質(zhì)體的研究及其體內(nèi)高效生物利用與活性評價
　　構建綠原酸納米脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，通過薄膜分散法制備綠原酸脂質(zhì)體，并考察其外觀、粒徑、包封率、穩(wěn)定性等性質(zhì)。建立HPLC法，用于測定綠原酸脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的生物利用度和小鼠體內(nèi)的組織分布情況，并進行方法學驗證。考察綠原酸脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的生物利用度及小鼠中的

4、組織分布情況，并考察綠原酸脂質(zhì)體對于小鼠體內(nèi)抗氧化藥效的影響，揭示脂質(zhì)體對生物利用度的影響與藥效作用之間的聯(lián)系。
　　1.綠原酸的提取與分離工藝的研究
　　以50％的乙醇提取杜仲粉末，采用無水乙醇、水對粗提物進行再次提取后，采用大孔樹脂與C8柱對其進行純化，得綠原酸白色粉末。采用1H-NMR與HPLC法對單體進行了結構與純度鑒定，結果表明，提取所得綠原酸的純度大于99.5%。
　　2.綠原酸脂質(zhì)體的制備及體外性質(zhì)考察<

5、br>　　構建綠原酸納米脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，通過薄膜分散法制備綠原酸脂質(zhì)體。所得綠原酸脂質(zhì)體為均勻的具有藍色微光混懸液，平均粒徑為132.15±3.03 nm，多分散性指數(shù)為0.18±0.08，Zeta電位為-23.08±2.41 mV，呈類球形均勻分布，大小與粒徑分布數(shù)據(jù)一致。透射電鏡觀察顯示，綠原酸脂質(zhì)體具有多層結構，屬于多層脂質(zhì)體。以葡聚糖凝膠色譜法測得綠原酸脂質(zhì)體的包封率為53.08±0.92%。初步穩(wěn)定性實驗結果表明，綠原酸脂質(zhì)體

6、具有較好的穩(wěn)定性，其平均粒徑、多分散性指數(shù)、包封率等主要指標均無明顯變化。
　　3.綠原酸脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)生物利用度與小鼠組織分布的考察
　　建立HPLC法，用于測定綠原酸脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的生物利用度和小鼠體內(nèi)的組織分布情況，并進行方法學驗證。色譜條件為：儀器：Shimadzu LC-10ATvp高效液相色譜儀；SPD-m10Avp二極管陣列檢測器；SIL-20A自動進樣器；色譜柱：Waters, Symmetry(C18,

7、4.6×150 mm,5μm)；流動相：甲醇-水（0.1%磷酸）（30:70）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：327 nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL；內(nèi)標：葛根素。線性范圍為0.125-50μg·mL-1（R2=0.9999），絕對回收率均＞85%，相對回收率在95.1%-102.4%之間，RSD均小于3%；日內(nèi)、日間精密度RSD<5%，樣品穩(wěn)定性良好，符合樣品體內(nèi)分析要求。
　　綠原酸大鼠體內(nèi)生物利用度研究結果

8、表明，口服給藥后，綠原酸脂質(zhì)體的Cmax和AUC0-11h相比于綠原酸原料藥均有顯著提高(p<0.01)，相對生物利用度為129.38%。綠原酸脂質(zhì)體的Tmax由原料藥的10 min推遲至15 min。游離綠原酸和綠原酸脂質(zhì)體均在120 min時出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。而t1/2雖然略有減小，但是無顯著性變化(p?0.05)。綠原酸脂質(zhì)體小鼠組織分布實驗表明，綠原酸納米脂質(zhì)體與綠原酸體內(nèi)分布情況具有較大差異。與原料藥相比，綠原酸脂質(zhì)體降低了藥物在

9、心臟中的分布，增加了在肝臟和脾臟中的蓄積。納米制劑延長了綠原酸在肝臟中的停留時間，延緩了其在體內(nèi)的代謝。同時發(fā)現(xiàn)，15和45 min時，原料藥中腎臟藥物分布較高，而綠原酸脂質(zhì)體在120 min時腎臟藥物分布較高，提示脂質(zhì)體可以延緩綠原酸在體內(nèi)的消除。
　　4.綠原酸脂質(zhì)體小鼠體內(nèi)抗氧化活性研究
　　建立四氯化碳小鼠肝損傷模型，考察綠原酸納米脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)對于抗氧化作用的提升效果，揭示生物高效利用與體內(nèi)藥理活性之間的關系。結果

10、表明：綠原酸及其脂質(zhì)體均具有較好的體內(nèi)抗氧化效果，二者對小鼠血漿和肝臟中的SOD、GSH-Px和T-AOC的活性均有顯著提高作用，而對MDA含量有顯著降低作用。而經(jīng)過脂質(zhì)體包封后，其體內(nèi)抗氧化活性較綠原酸原料藥顯著提高。CAL抗氧化效果的增加，很大程度上是由于CAL對CA生物利用度的提高和CA在肝臟的被動靶向作用而導致的肝臟中CA分布的增加。
　　第三章辣椒堿前藥自組裝納米粒的制備及性質(zhì)評價
　　本章將前藥自組裝納米技術應用

11、于辣椒堿的提高生物利用度與降低刺激性開發(fā)研究。以亞二硫基二乙酸為鏈接，合成辣椒堿-維生素E衍生物前藥（CAP-SVE），并進一步制備辣椒堿前藥自組裝納米粒（CAP-SVE NPs）。對CAP-SVE NPs進行形態(tài)觀察，溶解度，粒徑，電位，穩(wěn)定性等性質(zhì)評價，并考察其體外釋放特性。
　　1.以亞二硫基二乙酸為鏈接，合成CAP-SVE，前藥結構經(jīng)LC-MS、13C-NMR、1H-NMR分析，與設計結構相符。以面積歸一化法計算，純度大于

12、99.5%。制備
　　的CAP-SVE NPs對辣椒堿的增溶效果顯著，可達到8 mg?mL-1。
　　2.建立HPLC法同時測定辣椒堿和辣椒堿前藥的含量。色譜條件為：色譜柱：島津Shim-pack CLC-C8(M)（150×4.6 mmL.D）流動相：0.75%甲酸（A）-甲醇（B）；梯度洗脫：0 min70%B，2 min70%B，2.01 min100%B，15 min100%B；流速：1.0 mL?min-1；柱溫：

13、30℃；檢測波長：280 nm；進樣量：20μL。經(jīng)方法學驗證，線性范圍均為0.5-100μg?mL-1，日內(nèi)、日間精密度、樣品穩(wěn)定性均良好，符合檢測方法學要求。
　　3.對CAP-SVE NPs進行形態(tài)觀察，溶解度，粒徑，電位，穩(wěn)定性，體外釋放等性質(zhì)評價。CAP-SVE NPs平均粒徑為159.12±1.55 nm，多分散性指數(shù)為0.16±0.04，Zeta電位為-39.49±1.78 mV。透射電鏡觀察結果顯示，CAP-SVE

14、 NPs呈類球形均勻分布，且其粒徑大小與所測結果一致。理論濃度為2 mg·mL-1、4 mg·mL-1、8 mg·mL-1的CAP-SVE NPs的載藥量分別為1.93±0.02 mg?mL-1，3.97±0.04 mg?mL-1和7.95±0.03 mg?mL-1。CAP-SVE NPs具有較好的穩(wěn)定性，其含藥量和平均粒徑等主要指標在初步穩(wěn)定性實驗條件下均無明顯變化。體外釋藥實驗表明，辣椒堿自組裝納米粒在不同介質(zhì)中的釋藥行為大為不同。

15、在pH7.4的介質(zhì)中釋放辣椒堿最快，pH6.8的介質(zhì)中釋放較快，在水和pH1.2的介質(zhì)中幾乎無釋放。
　　第四章辣椒堿前藥脂質(zhì)體的制備及其體外性質(zhì)評價
　　本章將前藥自組裝納米技術與脂質(zhì)體納米技術相結合，進一步制備辣椒堿前藥脂質(zhì)體（CAP-SVE Liposome）。透射電鏡形態(tài)考察結果顯示，CAP-SVE Liposome呈類球形均勻分布，大小與粒徑分布所測得數(shù)據(jù)保持一致。平均粒徑為159.72±3.29nm，多分散性指數(shù)

16、為0.28±0.01，Zeta電位為-71.05±1.44 mV，包封率為98.33±0.68%。以外觀、粒徑及含藥量為指標評價CAP-SVE Liposome半個月的初步穩(wěn)定性，實驗表明，CAP-SVE Liposome在4℃、25℃、40℃條件下均非常穩(wěn)定，且結果與 CAP-SVE NPs穩(wěn)定性結果較為一致。以透析法研究CAP-SVE Liposome的體外釋藥特性，結果顯示，辣椒堿前藥納米脂質(zhì)體在水及pH1.2的釋藥介質(zhì)中，釋藥速

17、率以前藥計算，釋藥曲線與CAP-SVE NPs相比略緩。而在pH6.8及pH7.4的釋藥介質(zhì)中，釋藥速率以辣椒堿計算，顯著低于辣椒堿前藥納米粒。
　　第五章辣椒堿前藥自組裝納米粒及其脂質(zhì)體的體內(nèi)高效生物利用與組織分布研究
　　1.建立了HPLC法測定大小鼠血漿及小鼠組織中辣椒堿的含量。色譜條件：流動相：0.75%甲酸-甲醇（35:65）；流速：1.0 mL?min-1；柱溫：30℃；檢測波長：280 nm；進樣量：20μL。

18、線性范圍為0.1-10μg?mL-1，回收率、日內(nèi)、日間精密度、樣品穩(wěn)定性均良好，符合檢測方法學要求。
　　2.考察辣椒堿前藥自組裝納米粒及其脂質(zhì)體大鼠體內(nèi)生物利用度情況，結果顯示，與原料藥相比，CAP-SVE NPs和CAP-SVE Liposome大鼠注射給藥后Cmax顯著提高。兩種前藥納米制劑的辣椒堿大鼠體內(nèi)2小時內(nèi)藥時曲線下面積AUC0-2h值較原料藥顯著提高，分別為原料藥的2.1倍和3.3倍。而兩種前藥納米制劑的半衰期t

19、1/2相比于原料藥而言減小。口服給藥后，與辣椒堿原料藥相比，兩種辣椒堿前藥納米制劑大鼠體內(nèi)Cmax顯著提高，前藥自組裝納米粒和前藥脂質(zhì)體分別提高了1.92倍和1.81倍。Tmax和t1/2顯著延長?？诜o藥后，12小時內(nèi)藥時曲線下面積AUC0-12h顯著提高，CAP-SVE NPs和CAP-SVE Liposome的相對生物利用度分別為原料藥的3.2倍和4.4倍。結果表明，兩種辣椒堿前藥納米制劑顯著提高了辣椒堿的口服生物利用度，并具有緩

20、釋作用，且CAP-SVE Liposome的提高生物利用度和緩釋效果更好。
　　3.兩種辣椒堿前藥納米制劑小鼠體內(nèi)組織分布實驗表明，CAP-SVE NPs和CAP-SVE Liposome改變了辣椒堿的體內(nèi)分布特征。與原料藥相比，前藥及前藥脂質(zhì)體均增加了藥物在肝臟和脾臟中的靶向效果，延長了藥物作用時間，降低了藥物在腎臟的蓄積，且具有腦靶向效果。
　　第六章辣椒堿前藥自組裝納米粒及其脂質(zhì)體的胃腸道刺激性及藥效學研究
　　

21、本章通過考察辣椒堿前藥自組裝納米粒及其脂質(zhì)體對于胃腸道的刺激性、對于肝損傷小鼠抗氧化活性的影響以及降血脂藥效的影響，揭示辣椒堿前藥納米制劑分子結構與刺激性改變之間的關系及藥動特征與藥效提高之間的關系。
　　1.胃腸道刺激性實驗結果表明，與原料藥組相比，兩種辣椒堿前藥納米制劑對于胃粘膜無明顯的損傷，顯著降低辣椒堿的胃部刺激性。對于大鼠各段腸道，辣椒堿前藥納米制劑給藥后，十二指腸、空腸、回腸黏膜病理切片圖中腸粘膜黏膜組織結構完好，腸絨

22、毛結構較為完整，形態(tài)正常，而辣椒堿原料藥給藥后的各段腸粘膜組織細胞固縮、腸絨毛損傷嚴重。由此可見，CAP-SVE NPs及CAP-SVE Liposome均能顯著降低口服辣椒堿對于胃腸道的刺激性，且CAP-SVE Liposome效果更為明顯。
　　2.建立四氯化碳小鼠肝損傷模型，考察辣椒堿前藥自組裝納米粒及其脂質(zhì)體對于抗氧化作用的影響。小鼠體內(nèi)抗氧化活性研究結果表明：CAP-SVE NPs及CAP-SVE Liposome均能增

23、加辣椒堿在體內(nèi)的抗氧化活性。兩種前藥納米制劑均能減輕CCl4造成的小鼠肝臟水腫、充血等損傷，顯著降低了小鼠血漿中MDA的含量，顯著提高了小鼠血漿中T-SOD、GSH-Px和的T-AOC活性，相比于辣椒堿原料藥具有顯著性優(yōu)勢，且CAP-SVE Liposome相比于CAP-SVE NPs具有顯著性優(yōu)勢。
　　3.辣椒堿前藥納米制劑小鼠體內(nèi)降血脂活性研究結果表明：兩種辣椒堿前藥納米制劑均能顯著降低高血脂小鼠模型血漿中膽固醇、甘油三酯、

24、膽汁酸、低密度脂蛋白的水平，顯著提高高密度脂蛋白的水平；并顯著降低其肝臟總重、肝臟總脂肪含量以及肝臟總膽固醇及甘油三酯的水平。相比于辣椒堿原料藥，兩種辣椒堿前藥納米制劑具有顯著性優(yōu)勢，且CAP-SVE Liposome相比于CAP-SVE NPs具有顯著性優(yōu)勢。肝臟細胞HE染色病理切片表明，辣椒堿前藥納米制劑均能減少高脂飲食小鼠肝臟中脂肪滴的聚集，減輕肝細胞腫脹、脂肪變性等損傷。以上實驗表明，辣椒堿及其前藥納米制劑均能改善高脂飼料對小鼠