喜樹堿衍生物通過透明質酸納米微乳經(jīng)皮給藥作用于瘢痕修復的研究.pdf

1、透明質酸納米微乳經(jīng)皮藥物釋放體系,在皮膚滲透、定量給藥、藥物緩釋、延長藥效和淺表層病灶區(qū)定位方面體現(xiàn)了諸多優(yōu)勢。10,11-亞甲二氧基喜樹堿(MD-CPT)是喜樹堿衍生物的代表,具有很高的生物活性,能夠有效地阻礙DNA復制,阻止有絲分裂,抑制細胞增殖,是良好的抗腫瘤制劑。但是,MD-CPT的疏水性、內(nèi)酯環(huán)不穩(wěn)定性等理化性質限制了其體內(nèi)應用。透明質酸納米微乳作為MD-CPT的載體,可以克服MD-CPT的水難溶性、促進機體吸收、提高生物利用

2、度、增加藥物靶向性、減少毒副作用、維持血藥濃度、延長半衰期和提高藥效。瘢痕疙瘩(KD)被認為是一種良性腫瘤,其特征是成纖維細胞過度增殖,且受刺激易復發(fā)和加重病情,因此本文將載 MD-CPT透明質酸納米微乳應用于瘢痕疙瘩的修復研究,建立了一種溫和無創(chuàng)的經(jīng)皮給藥治療途徑。
　　對透明質酸進行修飾,成功制備了雙親性透明質酸單甘脂衍生物(HA-GMS)。通過紅外、核磁檢測證實了單甘酯成功地交聯(lián)到HA多糖主鏈上,以 FITC為熒光標記,以乙

3、二胺為鏈接壁,利用硫脲鍵將 FITC共價修飾在EDA-HA-GMS多糖主鏈上,得到FITC-HA-GMS,可以對HA-GMS載體材料進行定位示蹤與定量分析。溶血實驗表明,HA-GMS的溶血率均小于5％,符合生物醫(yī)用材料對溶血率的要求,具有較好的血液相容性。通過 MTT法檢測了HA-GMS的細胞毒性。
　　采用超聲乳化法,成功制備了不同組分配比的載MD-CPT的HANs納米微乳,平均粒徑是50~200nm,zeta電位絕對值是10~

4、20 mV,帶負電,均一性較好。通過透射電鏡觀察,納米粒均為完整的球形,大小均一,分布均勻,幾乎沒有聚集的現(xiàn)象,穩(wěn)定性良好。通過體外模擬實驗,考察了HANs納米微乳在皮膚表面的穩(wěn)定性,HANs納米微乳在pH4.0~7.4形態(tài)幾乎沒有變化,在pH>7.4是納米微乳表現(xiàn)出不規(guī)則的形狀,而且部分顆粒出現(xiàn)崩解的現(xiàn)象,說明HANs納米微乳在皮膚弱酸性環(huán)境下可以有效地遞送藥物。
　　MD-CPT/HANs納米微乳用于透皮擴散研究,角質層透過試

5、驗:0~4 h呈時間依賴性遞增,達到平衡時累積滲透量Qt為660.7±20.5μg/cm2,明顯高于對照組。全皮滲透性測定:Qt為51.7±9.5μg/cm2明顯低于角質層透過量,隨時間呈S型變化趨勢。不同HA-GMS:MD-CPT質量配比制得的載藥納米微乳的透皮擴散效率不同。Rhodamine B標記HA-GMS,利用熒光顯微鏡觀察到載藥納米乳透過角質層到達真皮層的擬動態(tài)過程,4h內(nèi),部分載藥納米微乳已經(jīng)到達真皮層,實現(xiàn)透皮。

6、　　血藥濃度與尿樣檢測,證明了HANs納米載體對MD-CPT具有緩釋的作用,多余的 MD-CPT進入了血液循環(huán),參與體內(nèi)的新陳代謝,最終被排出體外,不會成為機體負擔?；铙w成像研究體內(nèi)分布,進一步驗證了 MD-CPT在給藥區(qū)皮下組織的滯留時間較長,藥物濃度較高,形成了局部臨時藥物貯庫,可以不斷滲透到淺表層病灶區(qū),實現(xiàn)持續(xù)給藥、延長藥效的目的。另外,藥物含量:腎>肝>脾,進一步說明 MD-CPT參與了新陳代謝,并避開了對喜樹堿類藥物十分敏感

7、的消化道等組織器官。
　　與HSF、HUVECS、MCF-7、N2a等不同細胞株作用比較,證明了MD-CPT對細胞生長抑制、細胞吞噬和細胞周期調節(jié)都是有選擇的,效果明顯傾向于分裂活躍的增生性細胞。
　　MD-CPT對瘢痕成纖維細胞(KF)的抑制呈濃度依賴性。KF對FITC-HANs-MD-CPT細胞吞噬是一個時間依賴性的動態(tài)的過程,由胞外擴散到胞內(nèi)再到細胞核內(nèi)。將 MD-CPT/HANs作用于瘢痕皮膚,角質層變得膨脹、疏松,

8、局部呈現(xiàn)篩孔的結構,促進滲透。熒光顯微鏡證明了 Rhodamine-HANs-MD-CPT透過瘢痕疙瘩表皮直達真皮層的病變部位。 MD-CPT/HA-GMS作用KF細胞12 h,處于S期的細胞增加,24 h,48 h,處于S與G2/M的細胞均急劇減少,超過90%的細胞處于 G0/G1期,停止有絲分裂,出現(xiàn)了老化和凋亡的趨勢。實時熒光定量RT-PCR的結果,PAI-1表達水平下調,但是TGF-β、Smad3、Smad7上調,推測TGF-β

9、/SMAD—>PAI-1被Smad7阻斷。Western Blot顯示Smad2/3磷酸化水平顯著下降,印證了Smad7通過阻止Smad2/3磷酸化進而阻斷TGF-β/SMAD信號通路,使下游基因PAI-1表達水平下降,從而抑制瘢痕疙瘩再生。
　　綜上所述,通過體外、體內(nèi)實驗評價了雙親性的透明質納米微乳經(jīng)皮給藥體系的生物安全性,皮膚滲透性,細胞特異性及藥代動力學特性,并應用于治療瘢痕。研究表明,喜樹堿衍生物通過透明質酸納米微乳經(jīng)皮