基于在線微透析采樣與流動注射化學(xué)發(fā)光分析的抗體親和力測定新方法.pdf

1、隨著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，單克隆抗體技術(shù)在免疫治療、免疫分析、免疫純化等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在單克隆抗體的制備和篩選中，最重要的工作之一是對不同細胞株分泌的抗體的親和力這一關(guān)鍵指標進行評價。因此，研究快速、簡單、準確的抗體親和力測定新方法對于單克隆抗體的應(yīng)用具有非常重要的指導(dǎo)意義。微透析（microdialysis，MD）是一種微量采樣技術(shù)，具有可原位、活體采樣和在線、實時檢測等特點。其工作原理是外部介質(zhì)中的小分子物質(zhì)在濃度梯度差的作用

2、下，被動擴散通過透析膜到達探針腔中，而蛋白質(zhì)和細胞等大分子物質(zhì)則被阻擋在外，從而實現(xiàn)對小分子物質(zhì)的采樣。流動注射化學(xué)發(fā)光（flow injection-chemiluminescence，F(xiàn)I-CL）法是將微量、高速和自動化的進樣技術(shù)與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)結(jié)合而提出的一種痕量分析方法。其原理是待測物濃度與化學(xué)發(fā)光強度在一定范圍內(nèi)呈線性定量關(guān)系，利用儀器對反應(yīng)體系化學(xué)發(fā)光強度的測定，來確定待測物含量。本文將MD應(yīng)用于小分子半抗原采樣

3、，結(jié)合高靈敏度的FI-CL分析，以β-激動劑這一不宜直接標記的小分子半抗原為例，在均相條件下研究這些小分子半抗原與抗體間的親和力，建立了MD-FI-CL的在線聯(lián)用方法，用于測定抗體親和力，為小分子半抗原的抗體性能評價提供了一個新型的分析方法平臺。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用在線MD采樣方法，結(jié)合高靈敏度的FI-CL分析法，在均相體系中研究特布他林與其單克隆抗體之間的親和力，提出了用于測定單克隆抗體親和力的免標記型新方法。MD探

4、針可以將結(jié)合型特布他林及游離型抗體阻擋在半透膜外，從而實現(xiàn)對小分子半抗原（特布他林）的取樣，隨后將含有游離型半抗原的透析液注入FI-CL系統(tǒng)。堿性條件下，特布他林對魯米諾-鐵氰化鉀系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光有較強的增敏作用，因此，通過測定化學(xué)發(fā)光信號，可以實現(xiàn)透析液中特布他林的檢測。并通過MD探針的回收率校正，計算出免疫反應(yīng)體系中游離半抗原的濃度，最后通過Scatchard和Klotz公式，計算得到特布他林單克隆抗體的親和力。兩種計算方法所得結(jié)果均

5、為4.9×106 M-1，說明特布他林單克隆抗體是中等親和力的抗體，該結(jié)果與硫氰酸鹽洗脫法所得結(jié)果一致。該方法操作簡便、成本低、分析時間短，為單克隆抗體親和力的測定提供了新的途徑。⑵基于在線MD和FI-CL的聯(lián)用技術(shù)構(gòu)建了一種測定抗體親和力的免標記型新方法，用于直接測定萊克多巴胺與其單克隆抗體間的親和力常數(shù)。MD探針可以將結(jié)合型萊克多巴胺及游離型抗體阻擋在半透膜外，從而實現(xiàn)對免疫反應(yīng)體系中游離型萊克多巴胺的取樣，隨后將含有游離型半抗原的

6、透析液注入FI-CL系統(tǒng)。堿性條件下，萊克多巴胺對魯米諾-高錳酸鉀系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光有較強的增敏作用，因此，通過測定化學(xué)發(fā)光信號，可以實現(xiàn)對透析液中萊克多巴胺的檢測。并通過MD探針的回收率校正，計算出免疫反應(yīng)體系中游離半抗原的濃度，最后通過Scatchard和Klotz分析，計算得到萊克多巴胺單克隆抗體的親和力。兩種分析方法所得結(jié)果均為1.0×106 M-1，說明萊克多巴胺單克隆抗體是中等親和力的抗體，該結(jié)果與硫氰酸鹽洗脫法所得結(jié)果一致。因