丹酚酸B預(yù)防大鼠椎板切除術(shù)后硬膜外粘連的療效研究.pdf

1、腰椎手術(shù)失敗綜合征(FBSS)指一次或多次腰椎手術(shù)后，患者仍然出現(xiàn)復(fù)發(fā)性和/或持續(xù)性的下腰部疼痛，伴/不伴放射性神經(jīng)痛，全球發(fā)生率高達(dá)10％～40％。
　　造成FBSS有多種因素，圍繞圍手術(shù)期的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，可將因素概括為術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后因素。術(shù)前因素主要包括:①患者的心理社會(huì)因素;②手術(shù)相關(guān)因素;③診斷遺漏因素。術(shù)中因素主要包括:①手術(shù)技巧欠佳;②術(shù)中手術(shù)節(jié)段定位錯(cuò)誤;③過(guò)度減壓。術(shù)后因素主要包括:①椎間盤(pán)突出的復(fù)發(fā);②椎間隙感染;

2、③硬膜外粘連（epidural adhesion，EA）。椎板切除術(shù)為硬膜外腔隙的手術(shù)操作，術(shù)后愈合過(guò)程中硬膜外瘢痕組織的產(chǎn)生是難以避免的，過(guò)度增生的硬膜外瘢痕組織隨著不斷成熟形成硬膜外纖維化（epidural fibrosis，EF），可對(duì)神經(jīng)根形成擠壓、栓系，同時(shí)干擾腦脊液流動(dòng)，最終導(dǎo)致術(shù)后癥狀的發(fā)生、加重。
　　EA目前已成為引起FBSS的重要原因之一。目前，在EA治療方面，廣大學(xué)者已達(dá)成共識(shí)，最佳的治療方法即為預(yù)防EA形成

3、。國(guó)內(nèi)外廣大學(xué)者在預(yù)防EA形成方面做了大量的臨床與基礎(chǔ)研究工作，近期研究表明，已有學(xué)者通過(guò)動(dòng)物模型對(duì)EA預(yù)防做了廣泛嘗試，包括非甾體抗炎藥、免疫抑制劑、鈣通道阻滯劑、干細(xì)胞移植、自體脂肪移植、骨水泥移植、藥物凝膠應(yīng)用、蜂蜜等，這些研究均被證實(shí)可在一定程度上達(dá)到預(yù)防EA形成的目的。但迄今為止，尚沒(méi)有一種方法可在臨床得以廣泛推廣。
　　丹酚酸B(salvianolic acid,Sal B)是丹參的根莖提取物，為丹參主要的水溶性成分之

4、一，也是臨床上注射用丹參多酚酸鹽的主要構(gòu)成成分。近年來(lái)已有Sal B在抗纖維化、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡、清除自由基等方面的應(yīng)用和研究報(bào)道。已有學(xué)者通過(guò)Sai B在肝纖維化抑制方面、減緩肺纖維化進(jìn)展方面、防治糖尿病腎病方面、腫瘤殺傷方面、抑制缺血再灌注后腦血管炎癥方面、治療神經(jīng)退行性疾病方面等展開(kāi)了一些研究，并取得了一定成績(jī)。
　　基于上述研究背景，本課題擬采用椎板切除的動(dòng)物模型，探究Sal B在預(yù)防硬膜外粘連方面的安全

5、性、可行性與療效性，并初步探索其作用機(jī)制。整體研究分為兩個(gè)部分:
　　第一部分 丹酚酸B預(yù)防大鼠椎板切除術(shù)后硬膜外粘連的可行性研究。
　　在本部分研究中，60只Wistar大鼠隨機(jī)分為Sal B治療組、Vehicle對(duì)照組、單純手術(shù)對(duì)照組，每組20只。將丹酚酸B溶于生理鹽水中制備成濃度為7.5mg/ml的Sal B鹽水溶液。以電子秤稱(chēng)重動(dòng)物，以水合氯醛行腹腔注射進(jìn)行麻醉，注射量根據(jù)動(dòng)物體重(0.3ml/100g)。麻醉滿(mǎn)意后

6、對(duì)大鼠進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記，根據(jù)經(jīng)典的動(dòng)物腰椎板切除術(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化造模:選擇L1、L2節(jié)段備皮處理，以碘伏反復(fù)擴(kuò)大消毒3遍。大鼠鋪巾后取俯臥位，手術(shù)入路取背側(cè)的正中手術(shù)切口，長(zhǎng)度約為4～5cm，以尖刀逐層切開(kāi)皮膚，并剪開(kāi)深筋膜，鈍性分離L1～L2椎體椎旁肌，充分暴露L1～L2棘突，以咬骨鉗整體將棘突咬除，以蠶食法咬除椎板，顯露L1節(jié)段的硬脊膜，所開(kāi)的骨窗約為4mm×5mm。以生理鹽水沖洗傷口后行止血，無(wú)明顯出血點(diǎn)后關(guān)閉手術(shù)傷口。造模后觀(guān)察大鼠麻醉

7、復(fù)蘇情況，待度過(guò)危險(xiǎn)期后即行藥液灌胃治療:Sal B治療組采用丹酚酸B藥物溶液灌胃治療，劑量為30mg/kg/d，Vehicle組給予等體積的生理鹽水進(jìn)行灌胃治療，單純手術(shù)對(duì)照組不予治療干預(yù)。術(shù)后大鼠保持分籠飼喂，每籠不超過(guò)3只，室溫需維持在20～28℃之間。術(shù)后需進(jìn)行連續(xù)3天的肌肉注射抗生素，同時(shí)密切觀(guān)察大鼠傷口情況，防止感染。
　　造模4周后，以隨機(jī)原則從每組中抽選動(dòng)物。從每組動(dòng)物中抽選出5只進(jìn)行Rydell評(píng)分宏觀(guān)評(píng)估;從每

8、組動(dòng)物中抽選出5只，行過(guò)量麻醉處死，沿原手術(shù)切口進(jìn)入，暴露術(shù)野，小心剪取硬膜外瘢痕組織，烘干組織標(biāo)本，并將組織標(biāo)本冷凍貯存，行硬膜外瘢痕組織羥脯氨酸含量測(cè)定;從每組動(dòng)物抽選出5只，行過(guò)量麻醉致死后，沿原手術(shù)切口進(jìn)入，準(zhǔn)確定位并完整暴露L1節(jié)段椎體，以生理鹽水及PFA溶液灌注固定后，將L1椎體整體取下浸入至脫鈣試劑液中，待脫鈣滿(mǎn)意后行石蠟包埋并行組織塊切片，切片后行馬松三染色、蘇木精伊紅染色、VEGF免疫組織化學(xué)染色;從每組動(dòng)物中抽選出5

9、只，行過(guò)量麻醉處死，沿原手術(shù)切口進(jìn)入，取硬膜外瘢痕粘連組織，行烤箱標(biāo)本烘干，行Real-time PCR檢測(cè)硬膜外瘢痕組織中炎性因子表達(dá)情況。采用SPSS軟件包對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得量化數(shù)據(jù)以(-X)±s表示，采用單因素方差分析，采用q檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　造模后4周，各檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn):
　　Rydell評(píng)分可見(jiàn):Vehicle對(duì)照組和單純手術(shù)對(duì)照組的硬膜外瘢痕粘連程度較Sal

10、 B治療組重，可見(jiàn)嚴(yán)重的纖維組織增生，硬脊膜與術(shù)野瘢痕粘連嚴(yán)重，同時(shí)可見(jiàn)劇烈的炎癥反應(yīng)。Sal B治療組的粘連情況較Vehicle對(duì)照組和單純手術(shù)對(duì)照組明顯減輕，局部可見(jiàn)松散狀瘢痕組織，硬脊膜偶可見(jiàn)薄膜樣粘連，粘連不緊密，可順利將硬膜進(jìn)行分離。
　　羥脯氨酸檢測(cè)結(jié)果提示:Vehicle對(duì)照組羥脯氨酸含量為（50.34±4.19）mg，單純手術(shù)對(duì)照組羥脯氨酸含量為（53.59±3.27）mg，Sal B治療組羥脯氨酸含量為（31.5

11、4±5.06）mg。同單純手術(shù)對(duì)照組相比，Vehicle對(duì)照組羥脯氨酸含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)，Sal B治療組羥脯氨酸含量顯著降低(P＜0.05)。
　　馬松三染色結(jié)果可見(jiàn):L1椎體的石蠟切片馬松三染色結(jié)果提示:膠原纖維呈藍(lán)色，骨組織、肌纖維呈紅色，胞核呈藍(lán)褐色。Vehicle對(duì)照組和單純手術(shù)對(duì)照組可見(jiàn)致密膠原沉積，硬膜外瘢痕組織與硬膜粘連緊密;SalB治療組可見(jiàn)膠原纖維散在存在，硬膜與硬膜外瘢痕組織無(wú)明顯粘連。
　

12、　各組樣品的切片經(jīng)VEGF免疫組化染色后行光密度半定量結(jié)果提示:Sal B治療組VEGF半定量結(jié)果為12.31±6.42、Vehicle對(duì)照組VEGF半定量結(jié)果為50.27±4.39、單純手術(shù)對(duì)照組VEGF半定量結(jié)果為52.04±3.28，其中Vehicle對(duì)照組相較單純手術(shù)對(duì)照組，VEGF表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，Sal B治療組相較單純手術(shù)對(duì)照組及Vehicle對(duì)照組，VEGF表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。
　　第二部

13、分 丹酚酸B預(yù)防大鼠椎板切除術(shù)后硬膜外粘連的劑量研究。
　　在本部分研究中，40只Wistar大鼠隨機(jī)分為Sal B(10mg/kg)組、Sal B(30mg/kg)組、Sal B(50mg/kg)組、對(duì)照組（生理鹽水組），每組10只。將丹酚酸B溶于生理鹽水中分別制各成濃度為2.5mg/ml、7.5mg/ml及12.5mg/ml的Sal B鹽水溶液，充分震蕩使其溶解。動(dòng)物造模同上，給藥治療方式同上。造模8周后，每組動(dòng)物均行Ryde

14、ll評(píng)分宏觀(guān)評(píng)估;從每組動(dòng)物中以隨機(jī)原則抽選出5只，行過(guò)量麻醉致死后，沿原手術(shù)切口進(jìn)入，準(zhǔn)確定位并完整暴露L1節(jié)段椎體，以生理鹽水及10％PFA溶液灌注固定后，將L1椎體整體取下浸入至脫鈣試劑液中，待脫鈣滿(mǎn)意后行組織學(xué)染色觀(guān)察;造模8周后，從每組動(dòng)物中以隨機(jī)原則抽選出5只，行過(guò)量麻醉致死后，沿原手術(shù)切口進(jìn)入，以尖刀/剪刀剪取收集硬膜外瘢痕組織，行VEGF的Western Blot檢測(cè);采用SPSS16.0軟件包(SPSS Incorpo

15、ration，Chicago，IL，US)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得量化數(shù)據(jù)采用重復(fù)量測(cè)變異數(shù)分析，采用q檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的比較，以P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　造模后各組大鼠分籠飼養(yǎng)，各組大鼠在術(shù)后均出現(xiàn)一定程度的食欲不佳、少飲少排及體重下降，術(shù)后5～7天各組大鼠逐漸恢復(fù)正常。術(shù)后第4天有三只大鼠有血尿跡象，疑為手術(shù)創(chuàng)傷所致，未行特殊處理兩天后好轉(zhuǎn)。各組大鼠均順利存活至樣品收集，無(wú)死亡。
　　造模8周后，各檢測(cè)指標(biāo)結(jié)

16、果如下:
　　大鼠硬膜外瘢痕粘連情況Rydell評(píng)分可見(jiàn):對(duì)照組和Sal B(10mg/kg)組的硬膜外瘢痕粘連程度較重，可見(jiàn)嚴(yán)重的纖維組織增生，硬脊膜與術(shù)野瘢痕粘連嚴(yán)重，同時(shí)可見(jiàn)劇烈的炎癥反應(yīng)。Sal B(30mg/kg)組和Sal B(50mg/kg)組的粘連情況較輕，局部可見(jiàn)松散狀瘢痕組織，硬脊膜偶可見(jiàn)薄膜樣粘連，粘連不緊密，可順利將硬膜進(jìn)行分離。
　　L1椎體的石蠟切片HE染色結(jié)果提示:骨組織、肌纖維呈紅色，胞核呈藍(lán)

17、褐色。Sal B10mg/kg組和對(duì)照組可見(jiàn)硬膜外腔隙被瘢痕組織填充，并可見(jiàn)瘢痕組織擠壓硬膜并形成致密粘連;Sal B30mg/kg組與Sal B50mg/kg組可見(jiàn)硬膜外腔隙中散在松散的瘢痕組織，瘢痕組織與硬膜未形成明顯粘連。
　　本研究得出以下結(jié)論:
　　(1)丹酚酸B在預(yù)防大鼠椎板切除術(shù)后硬膜外粘連形成方面具有顯著效果;
　　(2)丹酚酸B在預(yù)防大鼠椎板切除術(shù)后硬膜外粘連方面呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，本研究結(jié)果提示相較10m