羥基喜樹堿通過調(diào)控NOXA表達預(yù)防椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕粘連的研究.pdf

1、目的:
　　探討四種不同濃度梯度的羥基喜樹堿(10-Hydroxycamptothecin，HCPT)局部使用對椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕粘連的預(yù)防作用，并進一步從細胞水平探究其預(yù)防硬膜外粘連的具體機制。
　　方法:
　　將72只Sprague-Dawley雄性大鼠平均四組，分別是0.2 mg/ml組、0.1 mg/ml組、0.05 mg/ml和生理鹽水對照組。采用1％濃度的戊巴比妥鈉對所有大鼠予腹腔注射麻醉后，進行常規(guī)術(shù)

2、前準備后，在L1-L2附近逐層進入后顯露椎體后面，使用微小咬骨鉗在L1椎板制造硬脊膜暴露區(qū)，面積大小約5mm×2mm，然后將各種不同濃度的HCPT和生理鹽水在紗布的保護下局部應(yīng)用于人工造成的骨缺損區(qū)，計時5分鐘，然后使用預(yù)先準備好的無菌生理鹽水沖洗殘留藥物，在關(guān)閉切口之前再次進行創(chuàng)口消毒，手術(shù)后連續(xù)3天使用抗生素肌肉注射治療以預(yù)防感染。28天后再次進行手術(shù)，逐層打開，對硬膜外區(qū)域行瘢痕粘連的大體評估，心臟灌注處死后，取下目標(biāo)椎體還有其周

3、圍的組織，對所有標(biāo)本實行脫鈣處理，然后使用石蠟包埋組織，行HE染色法在不同放大率的顯微鏡下觀察不同濃度HCPT對椎板切除術(shù)后粘連的預(yù)防以及局部成纖維細胞增殖抑制的效果，硬膜外瘢痕中NOXA的表達量的情況由免疫組織化學(xué)染色法測定，TUNEL檢測用來測定硬膜外瘢痕組織中成纖維細胞的凋亡率變化。體外培養(yǎng)成纖維細胞，予不同濃度的HCPT(0，1，2，4μg/ml)刺激成纖維細胞，TUNEL染色法觀察HCPT刺激成纖維細胞后細胞凋亡率的變化，We

4、stern-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達情況。予慢病毒載體敲除NOXA基因后，TUNEL染色法檢測觀察HCPT刺激后的成纖維細胞的凋亡率的變化，Western-blot檢測NOXA以及凋亡相關(guān)蛋白的表達量變化。
　　結(jié)果:
　　本實驗中所有的大鼠均未發(fā)生癱瘓、感染、死亡等現(xiàn)象。HE染色結(jié)果顯示:0.2 mg/mlHCPT組、0.1 mg/ml HCPT組以及0.05 mg/ml HCPT組的瘢痕粘連程度明顯好于對照組，而高倍

5、鏡下觀察到HCPT治療組硬膜外瘢痕組織中成纖維細胞數(shù)量明顯少于對照組硬膜外瘢痕中的成纖維細胞的數(shù)量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。對于硬膜外瘢痕組織中成纖維細胞的TUNEL染色顯示:成纖維細胞的凋亡率也升高趨勢和HCPT的劑量趨勢呈正相關(guān)。此外，硬膜外瘢痕組織中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示HCPT治療組中的NOXA表達量明顯多于對照組中NOXA的表達量，伴隨著HCPT濃度的升高，NOXA的表達量也呈現(xiàn)升高趨勢，提示NOXA的表達量的增

6、加可能與HCPT對硬膜外瘢痕粘連的抑制作用有關(guān)。體外細胞實驗的結(jié)果顯示HCPT能有效抑制成纖維細胞的細胞活性，TUNEL染色發(fā)現(xiàn)所有HCPT處理組的成纖維細胞凋亡率明顯多于對照組。Western-blot結(jié)果顯示應(yīng)用不同濃度的HCPT刺激成纖維細胞后，NOXA，cleaved-PARP，Bax的表達量隨著HCPT濃度的增高而升高，而Bcl-2的表達量則成相反趨勢，此外，使用慢病毒技術(shù)敲除NOXA之后，我們通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)成纖維細胞