擬南芥自體吞噬家族AtATG8轉(zhuǎn)基因苗的篩選及分子鑒定.pdf

1、植物在逆境脅迫下常常會因吸收不到足夠的營養(yǎng)物質(zhì)而不能維持正常的生理功能。低溫、干旱、ABA、高鹽等非生物脅迫是廣泛影響作物生產(chǎn)和植物生長的不利生境。當植物處于某一脅迫環(huán)境中時，植物會調(diào)控自身含有的與脅迫相關(guān)的基因的表達，產(chǎn)生相應(yīng)的適應(yīng)性。目前已經(jīng)克隆了許多脅迫相關(guān)基因，用于植物抗逆基因工程中，并得到了一些有一定抗逆性的轉(zhuǎn)基因植株，展示了廣闊的前景。 程序性細胞死亡是指為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主且有序性的死亡，它涉及

2、一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等，在真核生物發(fā)育、免疫調(diào)控和細胞穩(wěn)態(tài)平衡方面發(fā)揮了重要作用，因而是具有生理性和選擇性的。通常情況下，細胞死亡被分為細胞壞死和凋亡(PCD)。前者是因病理而產(chǎn)生的被動死亡，如由化學性或物理性的損害因子、缺氧或營養(yǎng)不良等條件引起的細胞壞死。后者是一種程序化的主動性細胞死亡，是通過依賴于caspases的蛋白家族定義的。但是大量研究結(jié)果表明還存在caspase非依賴性的細胞程序性死亡，已被人們初步認識的有自體吞

3、噬作用等途徑。 自體吞噬是廣泛存在于真核細胞中的一種溶酶體依賴性的降解途徑，它能引起細胞中長壽命蛋白的降解，參與細胞的正常生長發(fā)育過程和維持代謝平衡。在某些壓力條件下，如在損傷、營養(yǎng)匱乏、饑餓狀態(tài)等情況下，可以循環(huán)利用細胞組分最終使細胞得以生存，甚至在某些組織的癌變過程中也扮演重要角色。自體吞噬作為廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象，貫穿于正常細胞生長發(fā)育和生理病理過程，對防止如神經(jīng)退行性病變、腫瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病

4、以及對防止老化、延長壽命有積極作用。因此對細胞自噬作用和自噬型細胞死亡的研究不僅具有理論意義，而且也具有非常重要的應(yīng)用價值。自噬基因的發(fā)現(xiàn)使我們從分子水平認識了自噬，但對自噬起源、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其對細胞生存影響的了解尚不全面。隨著對自噬作用機制的深入研究，我們期望可以通過調(diào)控細胞的自噬水平，控制癌癥及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展，延緩衰老，提高生存質(zhì)量。 近年來由于分子生物學、基因組學等實驗手段的日臻完善，尤其是酵母自噬突變株的產(chǎn)生，使得對

5、自噬分子基礎(chǔ)的研究有了很大的進展。ATG8編碼的蛋白是自噬降解途徑中的核心蛋白。通過化學合成或剔除ATG8能抑制自體吞噬，從而阻止ROS積累和細胞死亡。這揭示了自體吞噬在細胞死亡中有很重要的作用機制。 本實驗采用RT—PCR方法，擴增得到ATG8e、ATG8f ATG8h，利用植物表達載體pCAMBIA3301(分別攜帶CamV35S，rd29A，SEN1啟動子)和農(nóng)桿菌GV3101將其在擬南芥中過量表達。用除草劑篩選獲得抗性苗

6、，并進一步得到純合系，然后對其進行了分子生物學的驗證并在脅迫條件下觀察表型。 轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學檢測如下： 1.轉(zhuǎn)基因植株均能通過PCR擴增出約500bp的Bar基因的特異性條帶，表明所構(gòu)建的載體已經(jīng)整合到擬南芥基因組中。 2.在所篩選到的rd29A—8f的純合株系中，隨機挑選三株(3—3—6，4—3—5，6—6—3)與野生型對照同時進行不同的脅迫處理(ABA、低溫、高鹽等)，24h后取材，提取植株的RNA并

7、進行RT—PCR。結(jié)果顯示：從整體上看，處理后的轉(zhuǎn)基因純合系A(chǔ)TG8f的表達量與處理前相比有不同程度上升，而野生型處理前后ATG8f含量差別不大。說明了在這些脅迫條件下，rd29A啟動子啟動ATG基因的表達。 同時，將純合系與野生型植株同時置于不同的脅迫條件下，如：干旱、低溫、ABA、NaCl，觀察各種植株在不同處理條件下的表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)干旱、低溫等脅迫條件下，自體吞噬發(fā)揮抗細胞死亡的作用，純合系比野生型生長良好；(2)