BMP2信號通路介導(dǎo)的腎動脈鈣化對糖尿病腎病進展的影響.pdf

1、目的:血管鈣化是糖尿病患者并發(fā)心血管疾病的主要表現(xiàn)之一，也是糖尿病患者死亡的重要危險因素。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)作為糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其發(fā)生發(fā)展和糖尿病血管損傷緊密相關(guān)。已有研究表明，糖尿病患者比非糖尿病患者更易發(fā)生動脈血管鈣化，而DN患者的鈣化程度更為嚴(yán)重及普遍。目前對DN血管鈣化的研究大多集中在外周動脈及冠狀動脈，而對腎動脈血管的改變知之甚少。本研究通過觀察糖尿病腎病基礎(chǔ)上給予增強血管鈣化

2、的因素后，腎動脈鈣化程度與腎功能進展的關(guān)系，同時觀察糖尿病腎病大鼠腎動脈上BMP2及其下游因子Smad1，Runx2和Osterix的基因及蛋白變化情況，探討糖尿病腎病時腎動脈鈣化嚴(yán)重程度與糖尿病腎病進展的關(guān)系，及BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信號通路激活在糖尿病腎病大鼠腎動脈鈣化的作用。
　　方法:將64只SD大鼠隨機分為對照組(CON組，18只)）、糖尿病腎病組(DN組，22只)、糖尿病腎病合并血管鈣化組(D

3、N+VDN組，24只)，DN組及DN+VDN組高脂飼料喂養(yǎng)4周后，予以單次腹腔注射1％鏈脲佐菌素(STZ)溶液35mg/kg誘導(dǎo)糖尿病，CON組注射同等體積的0.1mmol/L檸檬酸鹽緩沖液。72小時后測血糖，連續(xù)三天血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病成模。2周后，24 h尿蛋白量大于30 mg，尿量＞原尿量50％者為DN模型制備成功。DN成模第二天，DN+VDN組以維生素D3(300000U/kg)肌肉注射，將尼古丁(25 mg/k

4、g)完全溶解于花生油中給DN+VDN組大鼠灌胃，9h后再灌胃一次，其余兩組予等量花生油灌胃及生理鹽水肌注。8、12和16周時收集各組大鼠尿液檢測24小時尿白蛋白(24-h Upro);心臟采血檢測血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、空腹血糖、胱抑素C(CysC)。大鼠腎臟組織病理檢查:清潔取腎，石蠟包埋后行HE染色，觀察腎小球和腎小管間質(zhì)的基本病理改變情況。摘取雙側(cè)腎動脈用生理鹽水沖洗后，Von Kossa染色觀察大鼠腎動脈鈣鹽沉積，

5、并用鈣離子試劑盒檢測腎動脈組織鈣含量。免疫熒光雙染檢測各組大鼠腎動脈組織BMP2/α-SMA和Runx2/α-SMA蛋白表達(dá)變化。免疫組化檢測大鼠腎動脈組織BMP2、Smad1、Runx2及Osterix蛋白的表達(dá)。實時熒光定量(RT-PCR)檢測各組大鼠腎動脈組織BMP2和Runx2的基因表達(dá)。
　　結(jié)果:1、大鼠一般情況①體重:與CON組比較，模型組體重明顯減輕，但DN組及DN+VDN組各時間點體重?zé)o明顯統(tǒng)計學(xué)差異。②血糖:C

6、ON組血糖在正常水平范圍波動，DN組及DN+VDN組大鼠血糖值顯著高于同時間點CON組，且兩模型組間血糖無統(tǒng)計學(xué)差異。③血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr):與CON組相比，DN組及DN+VDN組大鼠BUN值于實驗8周后明顯升高，12周后DN組和DN+VDN組血Scr亦顯著升高(P＜0.05)，而DN組與DN+VDN組間BUN、Scr值均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。④胱抑素C(CysC):實驗期間，DN組大鼠血清Cys C水平明顯高于同時間點CO

7、N組，低于DN+VDN組(P＜0.05)。⑤24小時尿白蛋白(24-hUpro):8周后DN組及DN+VDN組大鼠24-h Upro較CON組開始上升，隨時間的延長進行性加重，并于16周末DN+VDN組大鼠的24-h Upro較同期DN組明顯升高(P＜0.05)。2、大鼠腎動脈鈣化的特征:①Von Kossa染色:CON組大鼠腎動脈組織各時間點均未見明顯異常，DN組及DN+VDN組大鼠8周末時即可見血管內(nèi)膜及中膜彈性纖維間大量黑色顆粒，

8、且隨著時間延長，沉積的黑色顆粒逐漸增多聚集成團。②鈣含量測定:隨時間的進展，三組大鼠鈣含量均逐漸增加，且DN+VDN組大鼠腎動脈組織各時間點鈣水平較DN組顯著升高，CON組大鼠較同期DN組明顯下降(P＜0.05)。3、免疫熒光檢測BMP2/α-SMA和Runx2/α-SMA的表達(dá):CON組大鼠腎動脈組織中可見BMP2及Runx2均少量表達(dá)且各時間點無明顯變化;與同期CON組大鼠相比，DN組和DN+VDN組大鼠腎動脈組織BMP2及Runx

9、2表達(dá)的綠色熒光強度相對較強，而α-SMA表達(dá)的紅色熒光相對較弱;與DN組相比，DN+VDN組大鼠腎動脈血管中可見BMP2及Runx2蛋白的表達(dá)較同期DN組增加，α-SMA的表達(dá)減少;此外，隨時間的推移，DN和DN+VDN組大鼠α-SMA的熒光強度也隨BMP2或Runx2蛋白表達(dá)的增強而減弱。4、BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信號蛋白免疫組化表達(dá):CON組腎動脈組織中BMP2、Smad1、Runx2及Osterix在血

10、管中膜均有散在微量表達(dá)。DN組大鼠腎動脈組織中可見BMP2、Smad1、Runx2和Osterix蛋白在實驗8周末時表達(dá)即開始明顯增加，陽性著色深，胞質(zhì)呈棕黃色，主要分布于動脈血管中膜平滑肌細(xì)胞中，隨時間的進展，表達(dá)逐漸增強。與同期DN組大鼠相比，可見DN+VDN組大鼠腎動脈組織BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信號通路的表達(dá)明顯升高。5、腎動脈組織BMP2及Runx2 mRNA的表達(dá):RT-PCR結(jié)果示，對照組大鼠腎動脈

11、組織BMP2、Runx2 mRNA僅有微量表達(dá)，且各時間點無統(tǒng)計學(xué)差異;模型組大鼠腎動脈組織自實驗第8周末起，BMP2和Runx2 mRNA水平開始增加，16周末時BMP2及Runx2 mRNA的表達(dá)量達(dá)最高值，此外，與DN組相比，DN+VDN組同期大鼠表現(xiàn)出更高的BMP2和Runx2 mRNA水平P＜0.05）。6、腎臟HE染色顯示:CON組大鼠各時間點未見明顯異常;8周末時DN組大鼠可見腎小球體積增大，基底膜輕度增厚，系膜區(qū)增寬，腎

12、小管上皮細(xì)胞偶見空泡樣或顆粒狀變性，隨時間的延長，12周末時可見基底膜增厚更明顯，偶見腎小動脈壁玻璃樣變性，16周末時腎組織損傷進一步加重，基底膜重度增厚，并可見節(jié)段性硬化;與DN組相比，DN+VDN組同期大鼠上述病理改變明顯加重。
　　結(jié)論:1、DN在較早階段時即已存在腎動脈等大血管的鈣化，而在鈣化血管中存在BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信號通路的激活;2、腎動脈鈣化的發(fā)生與嚴(yán)重程度與DN進展密切相關(guān);3、BM