寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶復合物的原核表達及活性研究.pdf

1、目的:本研究利用基因工程技術構建重組蛋白的原核表達體系并建立重組蛋白的純化工藝，表達寨卡病毒(ZIKV)的非結構蛋白NS2B的膜結合區(qū)域(NS2BH)和NS3具有蛋白酶活性的區(qū)域(NS3pro)，對表達的重組蛋白進行純化，并檢測其酶活性，為進一步研究NS2B-NS3蛋白酶復合物抑制劑打下基礎。
　　方法:
　　1.采用重疊PCR技術合成NS2BH和NS3pro基因序列，并引入Gly4-Thr-Gly4(G4TG4)氨基酸連接

2、臂的序列，最終構建出NS2BH-G4TG4-NS3pro靶序列;
　　2.用原核表達載體pET-28b(+)和靶序列構建目的蛋白表達載體pET-28b-NS2BH-G4TG4-NS3pro，轉化E.coli DH5α，獲得高拷貝的重組質粒。提取重組質粒的DNA，并對其進行序列分析。將經過DNA序列分析的重組質粒轉化E.coliBL21，采用菌落PCR技術進行鑒定。用IPTG誘導菌落PCR陽性的重組質粒表達目的蛋白。運用鎳柱親和層析

3、技術純化表達的重組蛋白;
　　3.使用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術，對重組蛋白酶復合物NS2BH-G4TG4-NS3pro進行鑒定;
　　4.采用熒光共振能量轉移(FRET)技術分析蛋白酶復合物NS2BH-G4TG4-NS3pro的活性。
　　結果:
　　1.成功的利用重疊PCR技術合成了NS2BH-G4TG4-NS3pro靶序列。構建出了pET-28b-NS2BH-G4TG

4、4-NS3pro原核表達載體。測序的結果顯示，目的序列和GenBank數據庫中的ZIKV標準毒株(MR766，GenBank NO.NC_012532)的參考序列完全相同;
　　2.重組工程菌經過IPTG的誘導，實現了NS2BH-G4TG4-NS3pro可溶性表達。重組蛋白經鎳柱親和層析技術純化后，最終獲得了預期分子量且高純度的可溶性蛋白;
　　3.MALDI-TOF MS的結果證明，本研究誘導表達的蛋白為NS2BH-G4T