可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的提取及其DNA適配體篩選的研究.pdf

1、侵襲性真菌?。↖nvasive fungal disease, IFD）系指真菌侵入人體，在組織、器官或血液中生長(zhǎng)、繁殖，并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及組織損傷的系統(tǒng)性感染性病變。該病在臨床上起病隱匿，主要并發(fā)于惡性腫瘤、糖尿病和自身免疫病等免疫功能下降的病人。隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑的廣泛使用及導(dǎo)管插管和器官移植等新技術(shù)的開展，侵襲性真菌病的發(fā)病率和死亡率急劇上升。侵襲性真菌病的療效和轉(zhuǎn)歸很大程度上取決于早期診斷，但由于病人的臨床表現(xiàn)不明顯、病理

2、組織活檢具有創(chuàng)傷性、真菌培養(yǎng)鑒定周期長(zhǎng)及真菌抗原和抗體檢測(cè)尚未完全成熟，目前臨床要早期準(zhǔn)確診斷IFD仍然非常困難。
　　近年來(lái)，侵襲性真菌病的血清學(xué)診斷試驗(yàn)有了一定的發(fā)展，通過(guò)檢測(cè)真菌細(xì)胞壁的特有結(jié)構(gòu)成分(1,3)-β-D-葡聚糖所建立的檢測(cè)方法呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。其中，以G試驗(yàn)為檢測(cè)原理的(1,3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)項(xiàng)目具有代表性。這類方法能夠?qū)崿F(xiàn)早期快速檢測(cè)，具有一定的敏感性和特異性，但仍存在較大局限性，檢測(cè)方法單一，影響

3、因素較多。葡聚糖自身理化性質(zhì)如分子量、分子構(gòu)象的改變均會(huì)影響活化G因子的能力，其中涉及的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)易受內(nèi)毒素干擾出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。因此，提高侵襲性真菌病的診斷效率具有非常重要的臨床意義。本研究計(jì)劃在獲得可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的基礎(chǔ)上，通過(guò)SELEX技術(shù)篩選與其結(jié)合的DNA適配體，為后續(xù)建立基于適配體的侵襲性真菌病感染性標(biāo)志物(1,3)-β-D葡聚糖的檢測(cè)新方法奠定基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1.建立酸堿法-氧化超聲法

4、提取白色念珠菌細(xì)胞壁中的可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖，為其DNA適配體的篩選研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　2.對(duì)提取的可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖進(jìn)行生物素標(biāo)記，使其可固定在鏈霉親和素磁珠上，便于DNA適配體的篩選。
　　3.應(yīng)用SELEX技術(shù)篩選與(1,3)-β-D-葡聚糖高親和力和高特異性結(jié)合的DNA適配體。測(cè)定已富集的DNA適配體的結(jié)合力和解離常數(shù)，為建立基于DNA適配體的(1,3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)新方法奠定基礎(chǔ)

5、。
　　4.分析以 G試驗(yàn)為原理的血清(1,3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)對(duì)侵襲性真菌病的診斷價(jià)值，為臨床科學(xué)應(yīng)用G試驗(yàn)診斷侵襲性真菌病提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用酵母膏胨葡萄糖（YPD）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)白色念珠菌，應(yīng)用酸堿法提取念珠菌細(xì)胞壁中的酸堿不溶性葡聚糖，并經(jīng)氧化超聲法處理獲得可溶性的(1,3)-β-D-葡聚糖。采用理化方法對(duì)可溶性的(1,3)-β-D-葡聚糖進(jìn)行定性及定量分析，利用紅外光譜對(duì)酸堿不溶性及可溶性

6、(1,3)-β-D-葡聚糖的糖苷鍵進(jìn)行鑒定分析。
　　2.采用高碘酸鈉氧化(1,3)-β-D-葡聚糖，經(jīng)乙二胺胺化后與硼氫化鈉反應(yīng)生成席夫堿（Schiff base），加入生物素酰-N-羥基丁二酰亞胺（BNHS），與反應(yīng)后的(1,3)-β-D-葡聚糖形成酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)生物素標(biāo)記。通過(guò)紅外光譜分析鑒定標(biāo)記產(chǎn)物。經(jīng)Sephadex G-200柱層析技術(shù)對(duì)標(biāo)記的(1,3)-β-D-葡聚糖進(jìn)行純化及分子量分析。
　　3.設(shè)計(jì)合成83n

7、t長(zhǎng)度的隨機(jī)單鏈DNA（ssDNA）文庫(kù)，與生物素標(biāo)記(1,3)-β-D-葡聚糖共同孵育，結(jié)合靶分子的ssDNA文庫(kù)洗脫后經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得雙鏈 DNA（dsDNA）庫(kù)，dsDNA解鏈成相應(yīng)的 ssDNA后用于下一輪篩選。經(jīng)過(guò)20輪SELEX篩選，ssDNA文庫(kù)經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆至T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后隨機(jī)挑取54個(gè)克隆菌進(jìn)行測(cè)序，利用Mfold軟件分析適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，測(cè)定適配體與(1,3)-β-D-葡聚糖的結(jié)合能力及其解離常數(shù)。

8、r>　　4.收集2014年1月至2015年7月間在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的52例侵襲性真菌病住院患者（IFD組）、50例革蘭陽(yáng)性菌血癥患者（G+菌組）、53例革蘭陰性菌血癥患者（G-菌組）的病例資料及41例健康對(duì)照組的檢驗(yàn)資料；分析52例侵襲性真菌病的致病菌分布情況及各組之間的G試驗(yàn)檢測(cè)水平，運(yùn)用受試者工作曲線（ROC）評(píng)估(1,3)-β-D葡聚糖檢測(cè)診斷IFD的最佳臨界值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS13.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四

9、分位間距）形式進(jìn)行描述，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.從白色念珠菌細(xì)胞壁中分離、提取了可溶性的(1,3)-β-D-葡聚糖，經(jīng)苯酚-硫酸法鑒定為多糖陽(yáng)性反應(yīng)，糖元和蛋白檢測(cè)均為陰性反應(yīng)；利用苯酚-硫酸法定量檢測(cè)，(1,3)-β-D-葡聚糖含量高達(dá)91.31％；采用紅外光譜分析其結(jié)構(gòu)，提取的葡聚糖在894cm-1有特征吸收峰，表明葡聚糖為β-構(gòu)

10、型，在1042 cm-1、1077 cm-1處有吸收峰，顯示結(jié)構(gòu)為D-吡喃糖苷。
　　2.生物素標(biāo)記的(1,3)-β-D-葡聚糖經(jīng)紅外光譜鑒定顯示，在1550cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，表明是新生成的酰胺鍵伸縮振動(dòng)；在849cm-1處出現(xiàn)的吸收峰則表示生物素標(biāo)記的長(zhǎng)鏈帶伸縮振動(dòng)。經(jīng)Sephadex G-200柱層析技術(shù)確定分子量約為143KDa。
　　3.經(jīng)過(guò)20輪篩選后進(jìn)行克隆測(cè)序，在獲得50條序列中，以90%以上一致性/同

11、源性的序列歸為一組，可分為9組，共包含23條序列，其中有8組具有兩條或以上的相同序列，篩選的ssDNA文庫(kù)得到了富集。運(yùn)用Mfold軟件分析各適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其以莖-環(huán)結(jié)構(gòu)為主，各適配體環(huán)的大小、位置、數(shù)量等存在區(qū)別。選擇8組具有2條以上相同序列的適配體進(jìn)行結(jié)合能力檢測(cè)，其中G1-45適配體的結(jié)合能力最高，Kd值為14.05±3.98 nM。
　　4.從52名IFD確診患者中分別檢出曲霉、假絲酵母菌屬、毛霉、馬爾尼菲青霉

12、和孢子菌等7種致病真菌屬。在IFD組中血清(1,3)-β-D-葡聚糖含量達(dá)124.1(60.39-218.13) pg/mL；G+菌組、G-菌組及健康對(duì)照組中(1,3)-β-D-葡聚糖含量分別為23.57(15.31-53.19) pg/mL、23.45(15.66-45.36) pg/mL和25.86(15.34-37.26) pg/mL。IFD組(1,3)-β-D-葡聚糖含量明顯高于其他三組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.183,-

13、4.337,-4.978, P<0.001）。G+菌組、G-菌組與健康對(duì)照組間兩兩比較則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。ROC曲線分析顯示血清(1,3)-β-D-葡聚糖水平用于診斷IFD的最佳臨界值是60.36 pg/mL，曲線下面積最大為0.759（P<0.001），95%可置信區(qū)間0.693-0.818，靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為76.9%、83.3%、62.5%和90.9%。
　　結(jié)論:
　　1.采

14、用酸堿法-氧化超聲法從白色念珠菌細(xì)胞壁中提取了可溶性的(1,3)-β-D-葡聚糖，為DNA適配體篩選的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　2.(1,3)-β-D-葡聚糖與生物素之間通過(guò)生成酰胺鍵進(jìn)行連接，經(jīng)紅外光譜分析顯示(1,3)-β-D-葡聚糖成功實(shí)現(xiàn)生物素標(biāo)記，利于后續(xù)的適配體篩選。
　　3.成功構(gòu)建了體外篩選(1,3)-β-D-葡聚糖DNA適配體的技術(shù)平臺(tái)，適配體與(1,3)-β-D-葡聚糖結(jié)合的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)是莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，獲得了一