蛋白質芯片技術在胃癌血清標志物及三氧化二砷作用靶點發(fā)現(xiàn)研究中的應用.pdf

1、隨著“人類基因組計劃”的完成和推進，生命科學研究已進入到系統(tǒng)生物學時代。蛋白質組學作為一門迅速崛起的系統(tǒng)生物學分支，通過研究機體在不同生理病理狀態(tài)下動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質與蛋白質之間的相互作用，來揭示蛋白質的功能與細胞的活動規(guī)律，在癌癥研究領域展現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿Α５鞍踪|芯片技術作為蛋白質組學研究的新興研究手段，以其高通量、并行、快速分析的優(yōu)勢在系統(tǒng)生物學研究中發(fā)揮著越來越重要的作用，必定能為癌癥的診斷和治

2、療研究提供很好的技術支持，使人們能夠較為系統(tǒng)地研究在癌癥診斷和治療過程中蛋白質的組成、變化規(guī)律。在本論文的研究中，我們利用蛋白質芯片技術，圍繞胃癌診斷和治療相關的生物學問題，開展了尋找胃癌新型血清生物標志物和藥物治療靶點的研究。
　　本論文首先將人蛋白質組芯片技術運用到胃癌血清樣品的蛋白組學研究中，成功篩選出胃癌早期診斷和預后的血清生物標志物。通過對三組血清樣本（胃癌組、高危人群組和健康對照組）的樣品處理、芯片反應和數(shù)據(jù)分析，在不

3、同血清樣本組間篩選出在三種抗體亞型（IgG、IgM、IgA）中存在顯著差異表達的自身抗體。通過更大規(guī)模的血清樣本在芯片上的驗證表明，我們篩選出44個在胃癌患者血清和健康人血清中顯著差異表達的自身抗體，其中4個在胃癌患者血清中的表達量顯著上調。我們對經(jīng)統(tǒng)計處理后排名最前的2個自身抗體，COPS2和CTSF，采用免疫酶聯(lián)反應和免疫組化在血清水平和癌組織水平進行了詳盡的后期驗證工作。結果顯示，自身抗體 COPS2和CTSF在胃癌患者的血清中和

4、蛋白質COPS2和CTSF在癌組織中的表達量跟正常對照組比較具有顯著差異。受試者工作特征曲線（ROC）分析結果顯示，COPS2和CTSF與目前臨床上使用的輔助胃癌診斷的生物標志物CEA的ROC曲線下面積分別為0.92、0.96和0.54，說明COPS2和CTSF用于胃癌診斷的準確性明顯優(yōu)于CEA；此外，COPS2和CTSF同樣也能用于胃癌患者預后的判斷。上述結果均說明，COPS2和CTSF是非常有潛力的胃癌早期診斷和預后判斷的血清標志物

5、。
　　接著，本論文將人蛋白質組芯片技術引入到As2O3的藥物作用靶點探尋的研究中。As2O3治療急性早幼粒細胞白血病的療效和機理十分明確，但是對實體腫瘤的殺傷作用機制不是很清楚。我們在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)As2O3能有效導致胃癌細胞凋亡，而誘導腫瘤細胞凋亡是藥物治療腫瘤最有效的方式?；诖耍覀兝萌说鞍踪|組芯片從系統(tǒng)水平進行 As2O3直接相互作用蛋白質的全局性發(fā)現(xiàn)，篩選出與As2O3直接相互作用的一些關鍵蛋白質，期望從中能找到

6、 As2O3誘導胃癌細胞凋亡的具體作用機制。我們對篩選到的蛋白質進行了體外、體內及功能方面的驗證。并通過生物學功能分析，發(fā)現(xiàn)在這些差異表達的蛋白質中，酶活性調節(jié)功能被顯著富集，主要集中在糖酵解途徑。我們進一步驗證了糖酵解途徑的重要限速酶己糖激酶 II在其中所發(fā)揮的作用。我們在選用人源胃癌細胞株SGC-7901基礎上，對細胞株進行己糖激酶II過表達的改造，結果表明過表達的己糖激酶II能顯著抑制As2O3對于胃癌細胞的殺傷作用，揭示了己糖激

7、酶II可以作為As2O3治療胃癌過程中重要的藥物作用靶點。
　　最后，我們應用超高液相色譜/串聯(lián)質譜(UPLC/MS/MS)和氣相色譜質譜聯(lián)用（GC/MS）平臺，對As2O3導致胃癌細胞凋亡的作用機制進行代謝組學方面的研究。我們通過對經(jīng)過As2O3處理6h、12h和24h的胃癌細胞株SGC-7901進行代謝產(chǎn)物的動態(tài)檢測分析，發(fā)現(xiàn)一部分代謝產(chǎn)物的變化集中在糖酵解途徑。其中6-磷酸葡萄糖、3-磷酸甘油醛、磷酸烯醇式丙酮酸以及乳酸的含

8、量均明顯下降。除此之外，我們還檢測到As2O3可以影響線粒體的功能、炎癥和氧化應激反應以及抑制多胺的代謝等。代謝組學從系統(tǒng)層次對As2O3影響胃癌細胞的整體通路做了詳細的檢測和分析，得到的數(shù)據(jù)不僅僅與蛋白質組學的數(shù)據(jù)相吻合，還找到了數(shù)個As2O3可能發(fā)揮作用的藥物作用靶點。由此可見，抑制糖酵解途徑可較有效地抑制胃癌細胞的增殖，同時As2O3可同時影響多個代謝通路的變化，可以從多方向多角度對胃癌的治療進行干預。
　　綜上所述，本課題