激素性股骨頭壞死血清蛋白標(biāo)志物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：股骨頭缺血壞死（ONFH）是骨科臨床的常見病、多發(fā)病，治療困難、致殘率高，是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尚未攻克的三大難題之一。原發(fā)性股骨頭缺血壞死與患者基因突變有關(guān)，繼發(fā)性股骨頭缺血壞死又分為非創(chuàng)傷性和創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死。創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死的發(fā)病原因較明確，為外傷導(dǎo)致病人股骨頭血管血流的中斷，從而引起骨細胞缺血并壞死。而非創(chuàng)傷性股骨頭壞死臨床上多見于長期大劑量使用激素和酗酒所導(dǎo)致，其發(fā)病機制尚不清楚，近年來，隨著皮質(zhì)類固醇激素在臨床上的廣泛

2、使用，股骨頭壞死病例也大幅增加。對于股骨頭缺血壞死的病理學(xué)研究尤為迫切，確切的發(fā)病機理將為尋找理想的治療方案奠定基礎(chǔ)。本研究項目旨在對長期大劑量使用激素的股骨頭缺血壞死病人，從大樣本的激素性股骨頭壞死（SONFH）病例中提取血清蛋白，按照ARCO分期（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期）進行分類，對血清蛋白進行全面系統(tǒng)的蛋白組學(xué)分析。此研究將彌補既往研究中病例少、忽略股骨頭壞死原因及病理分期的不足。通過以上蛋白組學(xué)的分析，篩得候選血清蛋白標(biāo)志物，根

3、據(jù)這些候選蛋白分子的差異表達進一步深入研究長期大劑量使用激素引起股骨頭壞死的發(fā)病機理。研究這些候選蛋白表達與股骨頭壞死分期的相關(guān)性，對股骨頭壞死預(yù)后進行預(yù)測并作為評估股骨頭壞死保髖治療療效的生化指標(biāo)。根據(jù)這些候選蛋白與股骨頭缺血壞死發(fā)病機理的相關(guān)性為今后尋找高效藥物治療確定方向，同時篩選出特異的生物標(biāo)志物，作為快速、特異的股骨頭壞死臨床早期診斷方法。
　　方法：
　　1、提取人血清總蛋白：根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，各抽取正常人

4、群及股骨頭壞死患者3mL靜脈血，離心、提純后收集血清，置于-80℃冰箱備用。
　　2、血清蛋白樣本處理：利用TCA/丙酮沉淀法處理蛋白樣本，試劑盒去除高豐度的白蛋白及球蛋白，得到最終樣本。
　　3、雙向凝膠電泳（2-DE）：對所制得膠條先后進行等點聚焦電泳（IEF）和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），取出凝膠條，進行考馬斯亮藍染色。
　　4、圖像分析：使用掃描儀進行掃描成像，考染圖像分析使用PDQuest8.0軟

5、件(Bio-Rad)進行分析。通過對分析膠的對比分析，可以找出比較組中表達呈現(xiàn)差異的蛋白點，這些差異蛋白點在考染凝膠中相對應(yīng)的蛋白斑點將作為質(zhì)譜分析的對象。
　　5、飛行時間質(zhì)譜分析（MALDI-TOF MS）：對目標(biāo)蛋白點進行胰蛋白酶酶切，提取多肽混合物。取0.3ul肽段提取液，與相等體積α-氰基-4-羥基肉桂酸飽和0.1TFA/50乙腈溶液混合后點于質(zhì)譜儀的樣品板上。按照說明進行操作。
　　6、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查詢：使用Ma

6、scot檢索軟件檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫，輸出結(jié)果報告。7、差異蛋白Western-Blot分析：選取纖維蛋白原γ鏈(FGG)和纖維蛋白原β鏈(FGB)，進行Western-Blot(蛋白免疫印跡），測量蛋白質(zhì)濃度含量，與2-DE試驗結(jié)果相驗證。
　　結(jié)果：通過2-DE分離出600±20個蛋白質(zhì)斑點，得到明顯差異蛋白點73個，挖取表達差異達2倍以上的差異巨大蛋白質(zhì)點11個，使用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀分析鑒定這些差異蛋白點，

7、得到蛋白質(zhì)4種，它們是纖維蛋白原γ鏈(FGG)、纖維蛋白原β鏈(FGB)、ATP合成酶、載脂蛋白AI(APOAI)。其中壞死組載脂蛋白AI(APOAI)表達下調(diào)，其余3種蛋白表達均上調(diào)。通過多數(shù)據(jù)庫查詢，這些蛋白參與分別涉及參與形成細胞骨架、能量代謝、氧化還原及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的功能，有可能成為潛在的蛋白標(biāo)志物。選取纖維蛋白原γ鏈(FGG)和纖維蛋白原β鏈(FGB)做Western-Blot，結(jié)果與2-DE結(jié)果相符。
　　結(jié)論：

8、r>　　1．從SONFH患者血清中分離股骨頭壞死相關(guān)蛋白質(zhì)，有助于闡明激素引起的股骨頭壞死的病理生理學(xué)機制，且取材方便，蛋白樣本處理容易，創(chuàng)傷小，患者容易接受。
　　2．使用雙向凝膠電泳(2-DE)能夠有效分離血清蛋白質(zhì)組，并獲得激素性股骨頭壞死（SONFH）的差異蛋白質(zhì)表達圖譜。
　　3．使用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀分析鑒定這些差異蛋白點，得到蛋白質(zhì)4種，進行生物學(xué)信息學(xué)分析，這些蛋白質(zhì)可能與SONFH的病理機制相