應(yīng)用新型納米金殼(pGSNs)材料治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌(PHC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其診斷和治療依舊在不斷的發(fā)展中，尤其是早期肝癌的診斷和治療尤為重要，其發(fā)病率在我國(guó)列第四位，肝癌的預(yù)后相對(duì)較差[1，2]。我國(guó)每年就有將近30萬(wàn)人死于肝癌，占癌癥死亡率的第二位，五年生存率較低。然而肝癌的發(fā)生發(fā)展都比較隱匿，早期即可出現(xiàn)門(mén)靜脈侵犯和全身多處轉(zhuǎn)移，目前肝癌的臨床治療方法主要集中在:外科手術(shù)切除、放射治療、化療、介入治療等，但每一種方法都有各自的局限性[3，4]，由

2、于手術(shù)損傷過(guò)大，化療引其全身副反應(yīng)較重，放療對(duì)腫瘤組織缺乏特異性，介入治療不徹底性等諸多限制，所以，人們期待一種損傷小、應(yīng)用劑量小且能特異性的清除腫瘤細(xì)胞同時(shí)對(duì)正常機(jī)體組織傷害較小的治療肝癌新手段的發(fā)現(xiàn)。
　　近些年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷拓展，與納米材料有機(jī)結(jié)合的物理治療腫瘤的新方法---光熱療逐漸進(jìn)入人們的關(guān)注范圍內(nèi)，這種治療方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，是利用納米材料獨(dú)有的理化性質(zhì)將外界吸收的光電能有效的轉(zhuǎn)換成熱能量，用來(lái)加熱局部病灶，

3、徹底殺死腫瘤細(xì)胞，例如:新型中空介孔二氧化硅納米金殼材料是其中獨(dú)具特點(diǎn)的典型代表。
　　現(xiàn)有的治療方法可以導(dǎo)致以下問(wèn)題:1）納米金殼材料其活體的生物安全性還有待于進(jìn)一步探討2）經(jīng)靜脈注射pGSNs后，可被正常組織攝取，生物分布情況有待于進(jìn)一步研究;3）NIR的穿透力較差，很難照射到較深的組織。
　　基于以上現(xiàn)有的研究，我們需要充分暴露腫瘤組織，通過(guò)照射納米金殼使其產(chǎn)熱，行使其熱消融的功能，達(dá)到治療腫瘤的目的。同時(shí)我們可以考慮

4、轉(zhuǎn)變以往經(jīng)過(guò)靜脈注射納米金殼的方式，經(jīng)肝動(dòng)脈直接注入，然后進(jìn)行相關(guān)研究，目前臨床介入治療肝癌的方式為:肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)即為抗腫瘤藥物與各種各樣的栓塞材料混合的方式經(jīng)導(dǎo)管注入進(jìn)行栓塞肝動(dòng)脈，因此，我們創(chuàng)新性的設(shè)想一種方法把pGSNs通過(guò)導(dǎo)管注入肝動(dòng)脈進(jìn)行栓塞，再通過(guò)外照射使pGSNs產(chǎn)熱達(dá)到熱消融的效果，這種方法在國(guó)內(nèi)外尚未應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。如果驗(yàn)證以上的設(shè)想，我們需要考慮以下三個(gè)問(wèn)題:1）pGSNs的活體生物安全性的問(wèn)題;2）

5、同時(shí)研究pGSNs在體外的產(chǎn)熱效率問(wèn)題;3）對(duì)于肝癌治療，我們?cè)O(shè)想把pGSNs與肝癌的介入治療（TAE）結(jié)合起來(lái)，通過(guò)DSA引導(dǎo)把pGSNs經(jīng)肝動(dòng)脈插管注射進(jìn)入肝動(dòng)脈，并在特定能量的近紅外線下進(jìn)行照射，最后需要分析肝癌組織的體積變化及病理學(xué)指標(biāo)變化并推測(cè)可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)1:共選擇24只健康的小鼠，把小鼠隨機(jī)分成四組，每組6只，pGSNs的劑量設(shè)置分別為5mg/kg，25mg/kg和50 mg/kg以及空

6、白對(duì)照組。所有組別里的小鼠均采用靜脈注射的方式進(jìn)行給藥，每隔2天注射1次，連續(xù)注射7次。在注射結(jié)束后的第1d和30d，殺死小鼠并采集不同器官。比較分析三個(gè)濃度條件下小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的臟器攝取指數(shù)。在實(shí)驗(yàn)期間對(duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取心、肝、脾、肺和腎臟用甲醛固定，按照標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)主要臟器進(jìn)行切片和染色，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析。同時(shí)對(duì)各組小鼠給藥后的血液生化指標(biāo)進(jìn)行比較分析。
　　實(shí)驗(yàn)2:選擇不同濃度的納米金殼材料

7、進(jìn)行近紅外線的照射，并同時(shí)使用近紅外線熱成像儀進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溫度。將L929、HePG2細(xì)胞接種到96孔板中，孵育培養(yǎng)48h后，加入在5％二氧化碳37℃恒溫培養(yǎng)箱中將上述細(xì)胞孵育培養(yǎng)24h后，將pGSNs稀釋成一定濃度，按照1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL劑間比加各濃度劑量材料100μL;并在空白孔和對(duì)照孔補(bǔ)充培養(yǎng)基;孵育4h后，用808nm的激光器照射，功率為1w，照射時(shí)間為3

8、min。觀察腫瘤細(xì)胞的抑制情況并進(jìn)行細(xì)胞相容性的測(cè)定。同時(shí)為了下一步實(shí)驗(yàn)我們制作了兔子VX2肝臟腫瘤模型。
　　實(shí)驗(yàn)3:第二部分種植好的兔肝VX2腫瘤模型36只，分為六組，每組的腫瘤基線大小不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。六組分別為:空白對(duì)照組、靜脈注入金殼組、動(dòng)脈注入金殼組、靜脈金殼+NIR組、動(dòng)脈金殼+NIR組、單純NIR組。每組納米金殼注入的量均等為1mg/ml，CT掃描于基線資料、3天、6天、9天、12天及15天在所有組

9、進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察不同組別的兔子肝內(nèi)腫瘤的大小變化情況。動(dòng)脈治療組及靜脈治療組動(dòng)物處死后取各器官組織進(jìn)行金離子濃度檢測(cè)。動(dòng)物處死后各組標(biāo)本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的HE染色。觀察動(dòng)脈治療組、靜脈治療組及對(duì)照組動(dòng)物處死后進(jìn)行肝臟腫瘤的TUNEL染色。動(dòng)脈治療組、靜脈治療組及對(duì)照組動(dòng)物處死后進(jìn)行肝臟腫瘤的免疫組化染色。并對(duì)各組動(dòng)物的血常規(guī)及生化指標(biāo)進(jìn)行分析比較。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)1:和對(duì)照組相比，在給藥期間(1-21d)和毒性觀察期(2

10、7-50d)間各實(shí)驗(yàn)組的小鼠體重逐漸增加，并且低劑量組和高劑量組之間小鼠的體重增長(zhǎng)速度并無(wú)明確的變化。而在毒性觀察期間小鼠的體重增長(zhǎng)緩慢，但是體重變化無(wú)顯著的差異。和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟和脾臟的金殼攝取有明顯升高的趨勢(shì)，而其他臟器指數(shù)無(wú)顯著的變化。而繼續(xù)飼養(yǎng)30天恢復(fù)期內(nèi)，高劑量組小鼠的肝臟和脾臟攝取等指標(biāo)降低，說(shuō)明pGSNs對(duì)肝臟和脾臟的損傷是可逆的，pGSNs對(duì)小鼠的毒性影響很小，小鼠生活正常。小鼠的各臟器組織未見(jiàn)

11、明顯異常，血生化測(cè)試可以反映肝功能和腎功能，不同劑量的pGSNs未對(duì)小鼠的肝腎功能造成明顯影響。
　　實(shí)驗(yàn)2:從不同濃度pGSNs的升溫效率來(lái)看，隨著濃度的增加，升溫速度也增加，說(shuō)明pGSNs材料可以用來(lái)作為一種良好的光熱轉(zhuǎn)換試劑。在濃度為100μg/mL時(shí)由于pGSNs濃度較高，有很多的腫瘤細(xì)胞被加熱殺死，高濃度納米金殼光熱治療對(duì)Hep G2腫瘤細(xì)胞的抑制率高達(dá)到85.4％。然后對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞生物相容性評(píng)價(jià)可以發(fā)現(xiàn)其具有較低的細(xì)胞

12、毒性。兔子VX2肝癌模型建立順利，模型成功率較高。
　　實(shí)驗(yàn)3:結(jié)果表明，與靜脈注射金殼組動(dòng)物相比，經(jīng)動(dòng)脈介入注射的動(dòng)物在CT成像中可見(jiàn)金殼增強(qiáng)CT成像效果。在靜脈注射組，金殼顆粒主要分布在肝脾臟器中，而在動(dòng)脈介入組，金殼顆粒主要分布在腫瘤中。在注射后4小時(shí)，金殼含量占總含量的60％，是靜脈注射組的6倍之多。在注射后24小時(shí)，雖然腫瘤金殼含量有所降低，但仍是靜脈組的3倍。以上結(jié)果表明，臨床介入技術(shù)可以大大提高納米金殼在腫瘤內(nèi)的富集

13、和靶向。
　　六組動(dòng)物分別注射等量的納米金殼材料，利用CT成像診斷對(duì)腫瘤治療預(yù)后情況進(jìn)行跟蹤觀察。我們發(fā)現(xiàn):對(duì)照組、肝動(dòng)脈注入金殼組、靜脈注入金殼組的腫瘤生長(zhǎng)迅速，同時(shí)在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，動(dòng)物耐受性差，而在治療后第9天，對(duì)照組和單純NIR組動(dòng)物發(fā)生死亡，而動(dòng)脈介入治療組動(dòng)物生存期明顯延長(zhǎng)到了15天，同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈治療組在CT表現(xiàn)上腫瘤面積顯著縮小。與對(duì)照組和單純NIR組相比，動(dòng)脈介入治療組腫瘤面積顯著降低，差異性明顯。而靜脈

14、治療組的腫瘤變化較小，但較其余對(duì)照組有明顯的差異。以上結(jié)果表明該治療方案可以大大提高動(dòng)物生存期，改善動(dòng)物生活質(zhì)量，有效抑制腫瘤發(fā)展，我們發(fā)現(xiàn)治療組及對(duì)照組的動(dòng)物體重未見(jiàn)明顯差異，結(jié)果表明:納米金殼材料無(wú)論經(jīng)過(guò)何種路徑注入動(dòng)物體內(nèi)未影響各組動(dòng)物的體重情況，具有一定的生物安全性。動(dòng)脈治療組的局部腫瘤溫度上升明顯，在三分鐘的時(shí)間內(nèi)局部溫度迅速升高到55℃左右，可以造成腫瘤細(xì)胞的大量壞死及凋亡，而其余對(duì)照組升溫效率較差，三分鐘內(nèi)升到28℃左右。

15、
　　在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們把每一組的動(dòng)物處死，取每一個(gè)組的心臟、肝臟、脾肺、腎臟等正常組織進(jìn)行HE染色，未見(jiàn)明顯異常。同時(shí)我們?nèi)∶恳唤M的腫瘤組織，我們發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈治療組可見(jiàn)腫瘤組織的大量壞死，而其余組的腫瘤組織壞死較不明顯，動(dòng)脈介入給藥后局部腫瘤組織內(nèi)的納米金殼含量增加，然后暴露腫瘤后給予近紅外激光照射治療可以大量殺死腫瘤組織，達(dá)到充分熱消融的目的。動(dòng)脈治療組的腫瘤組織內(nèi)可見(jiàn)大量的腫瘤細(xì)胞壞死和凋亡，而靜脈組和其余對(duì)照組的壞死凋亡較少，

16、動(dòng)脈治療組具有較明顯的深褐色顆粒染色，靜脈組和其余對(duì)照組未見(jiàn)明顯的caspase3和9的凋亡染色。各組之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較發(fā)現(xiàn)，差異性明顯。在第三部分試驗(yàn)中，我們改變了傳統(tǒng)的靜脈給藥的方式，通過(guò)介入手段進(jìn)行給藥，提高腫瘤靶向性和光熱治療的效率。我們同樣分析了給藥后3、6、9、12和15天各組動(dòng)物的血常規(guī)及生化指標(biāo)的變化情況，未見(jiàn)明顯異常。
　　結(jié)論：
　　1、我們對(duì)pGSNs進(jìn)行了活體動(dòng)物的急性和亞慢性毒性研究，結(jié)果表明，pGS

17、Ns具有非常好的生物相容性。pGSNs經(jīng)靜脈注射重復(fù)7次后，5mg/kg不會(huì)引起動(dòng)物明顯的損傷，而在25mg/kg和50 mg/kg時(shí)會(huì)引起肝臟、肺臟和腎臟的損傷，特別是在恢復(fù)期期間pGSNs表現(xiàn)出更明顯的毒性，說(shuō)明pGSNs具有遲發(fā)的毒性效應(yīng)。
　　2、pGSNs在近紅外線激光的照射下可以有效的、快速的產(chǎn)生熱能，具有較高的產(chǎn)熱效率。pGSNs在近紅外線照射下可以有效的抑制腫瘤細(xì)胞的增值，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，且其具有良好的細(xì)胞安全