應(yīng)用新型納米金殼(pGSNs)材料治療肝癌的實驗研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌(PHC)是常見的惡性腫瘤之一，其診斷和治療依舊在不斷的發(fā)展中，尤其是早期肝癌的診斷和治療尤為重要，其發(fā)病率在我國列第四位，肝癌的預(yù)后相對較差[1，2]。我國每年就有將近30萬人死于肝癌，占癌癥死亡率的第二位，五年生存率較低。然而肝癌的發(fā)生發(fā)展都比較隱匿，早期即可出現(xiàn)門靜脈侵犯和全身多處轉(zhuǎn)移，目前肝癌的臨床治療方法主要集中在:外科手術(shù)切除、放射治療、化療、介入治療等，但每一種方法都有各自的局限性[3，4]，由

2、于手術(shù)損傷過大，化療引其全身副反應(yīng)較重，放療對腫瘤組織缺乏特異性，介入治療不徹底性等諸多限制，所以，人們期待一種損傷小、應(yīng)用劑量小且能特異性的清除腫瘤細胞同時對正常機體組織傷害較小的治療肝癌新手段的發(fā)現(xiàn)。
　　近些年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷拓展，與納米材料有機結(jié)合的物理治療腫瘤的新方法---光熱療逐漸進入人們的關(guān)注范圍內(nèi)，這種治療方法具有獨特的優(yōu)勢，是利用納米材料獨有的理化性質(zhì)將外界吸收的光電能有效的轉(zhuǎn)換成熱能量，用來加熱局部病灶，

3、徹底殺死腫瘤細胞，例如:新型中空介孔二氧化硅納米金殼材料是其中獨具特點的典型代表。
　　現(xiàn)有的治療方法可以導(dǎo)致以下問題:1）納米金殼材料其活體的生物安全性還有待于進一步探討2）經(jīng)靜脈注射pGSNs后，可被正常組織攝取，生物分布情況有待于進一步研究;3）NIR的穿透力較差，很難照射到較深的組織。
　　基于以上現(xiàn)有的研究，我們需要充分暴露腫瘤組織，通過照射納米金殼使其產(chǎn)熱，行使其熱消融的功能，達到治療腫瘤的目的。同時我們可以考慮

4、轉(zhuǎn)變以往經(jīng)過靜脈注射納米金殼的方式，經(jīng)肝動脈直接注入，然后進行相關(guān)研究，目前臨床介入治療肝癌的方式為:肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)即為抗腫瘤藥物與各種各樣的栓塞材料混合的方式經(jīng)導(dǎo)管注入進行栓塞肝動脈，因此，我們創(chuàng)新性的設(shè)想一種方法把pGSNs通過導(dǎo)管注入肝動脈進行栓塞，再通過外照射使pGSNs產(chǎn)熱達到熱消融的效果，這種方法在國內(nèi)外尚未應(yīng)用于實驗研究。如果驗證以上的設(shè)想，我們需要考慮以下三個問題:1）pGSNs的活體生物安全性的問題;2）

5、同時研究pGSNs在體外的產(chǎn)熱效率問題;3）對于肝癌治療，我們設(shè)想把pGSNs與肝癌的介入治療（TAE）結(jié)合起來，通過DSA引導(dǎo)把pGSNs經(jīng)肝動脈插管注射進入肝動脈，并在特定能量的近紅外線下進行照射，最后需要分析肝癌組織的體積變化及病理學(xué)指標變化并推測可能的分子機制。
　　方法：
　　實驗1:共選擇24只健康的小鼠，把小鼠隨機分成四組，每組6只，pGSNs的劑量設(shè)置分別為5mg/kg，25mg/kg和50 mg/kg以及空

6、白對照組。所有組別里的小鼠均采用靜脈注射的方式進行給藥，每隔2天注射1次，連續(xù)注射7次。在注射結(jié)束后的第1d和30d，殺死小鼠并采集不同器官。比較分析三個濃度條件下小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的臟器攝取指數(shù)。在實驗期間對小鼠進行稱重。實驗結(jié)束后，取心、肝、脾、肺和腎臟用甲醛固定，按照標準的方法對主要臟器進行切片和染色，進行組織形態(tài)學(xué)分析。同時對各組小鼠給藥后的血液生化指標進行比較分析。
　　實驗2:選擇不同濃度的納米金殼材料

7、進行近紅外線的照射，并同時使用近紅外線熱成像儀進行實時監(jiān)測溫度。將L929、HePG2細胞接種到96孔板中，孵育培養(yǎng)48h后，加入在5％二氧化碳37℃恒溫培養(yǎng)箱中將上述細胞孵育培養(yǎng)24h后，將pGSNs稀釋成一定濃度，按照1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL劑間比加各濃度劑量材料100μL;并在空白孔和對照孔補充培養(yǎng)基;孵育4h后，用808nm的激光器照射，功率為1w，照射時間為3

8、min。觀察腫瘤細胞的抑制情況并進行細胞相容性的測定。同時為了下一步實驗我們制作了兔子VX2肝臟腫瘤模型。
　　實驗3:第二部分種植好的兔肝VX2腫瘤模型36只，分為六組，每組的腫瘤基線大小不具備統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。六組分別為:空白對照組、靜脈注入金殼組、動脈注入金殼組、靜脈金殼+NIR組、動脈金殼+NIR組、單純NIR組。每組納米金殼注入的量均等為1mg/ml，CT掃描于基線資料、3天、6天、9天、12天及15天在所有組

9、進行，實驗過程中，觀察不同組別的兔子肝內(nèi)腫瘤的大小變化情況。動脈治療組及靜脈治療組動物處死后取各器官組織進行金離子濃度檢測。動物處死后各組標本進行標準的HE染色。觀察動脈治療組、靜脈治療組及對照組動物處死后進行肝臟腫瘤的TUNEL染色。動脈治療組、靜脈治療組及對照組動物處死后進行肝臟腫瘤的免疫組化染色。并對各組動物的血常規(guī)及生化指標進行分析比較。
　　結(jié)果：
　　實驗1:和對照組相比，在給藥期間(1-21d)和毒性觀察期(2

10、7-50d)間各實驗組的小鼠體重逐漸增加，并且低劑量組和高劑量組之間小鼠的體重增長速度并無明確的變化。而在毒性觀察期間小鼠的體重增長緩慢，但是體重變化無顯著的差異。和對照組相比，實驗結(jié)束后實驗組小鼠的肝臟和脾臟的金殼攝取有明顯升高的趨勢，而其他臟器指數(shù)無顯著的變化。而繼續(xù)飼養(yǎng)30天恢復(fù)期內(nèi)，高劑量組小鼠的肝臟和脾臟攝取等指標降低，說明pGSNs對肝臟和脾臟的損傷是可逆的，pGSNs對小鼠的毒性影響很小，小鼠生活正常。小鼠的各臟器組織未見

11、明顯異常，血生化測試可以反映肝功能和腎功能，不同劑量的pGSNs未對小鼠的肝腎功能造成明顯影響。
　　實驗2:從不同濃度pGSNs的升溫效率來看，隨著濃度的增加，升溫速度也增加，說明pGSNs材料可以用來作為一種良好的光熱轉(zhuǎn)換試劑。在濃度為100μg/mL時由于pGSNs濃度較高，有很多的腫瘤細胞被加熱殺死，高濃度納米金殼光熱治療對Hep G2腫瘤細胞的抑制率高達到85.4％。然后對其進行細胞生物相容性評價可以發(fā)現(xiàn)其具有較低的細胞

12、毒性。兔子VX2肝癌模型建立順利，模型成功率較高。
　　實驗3:結(jié)果表明，與靜脈注射金殼組動物相比，經(jīng)動脈介入注射的動物在CT成像中可見金殼增強CT成像效果。在靜脈注射組，金殼顆粒主要分布在肝脾臟器中，而在動脈介入組，金殼顆粒主要分布在腫瘤中。在注射后4小時，金殼含量占總含量的60％，是靜脈注射組的6倍之多。在注射后24小時，雖然腫瘤金殼含量有所降低，但仍是靜脈組的3倍。以上結(jié)果表明，臨床介入技術(shù)可以大大提高納米金殼在腫瘤內(nèi)的富集

13、和靶向。
　　六組動物分別注射等量的納米金殼材料，利用CT成像診斷對腫瘤治療預(yù)后情況進行跟蹤觀察。我們發(fā)現(xiàn):對照組、肝動脈注入金殼組、靜脈注入金殼組的腫瘤生長迅速，同時在短時間內(nèi)出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，動物耐受性差，而在治療后第9天，對照組和單純NIR組動物發(fā)生死亡，而動脈介入治療組動物生存期明顯延長到了15天，同時可以發(fā)現(xiàn)動脈治療組在CT表現(xiàn)上腫瘤面積顯著縮小。與對照組和單純NIR組相比，動脈介入治療組腫瘤面積顯著降低，差異性明顯。而靜脈

14、治療組的腫瘤變化較小，但較其余對照組有明顯的差異。以上結(jié)果表明該治療方案可以大大提高動物生存期，改善動物生活質(zhì)量，有效抑制腫瘤發(fā)展，我們發(fā)現(xiàn)治療組及對照組的動物體重未見明顯差異，結(jié)果表明:納米金殼材料無論經(jīng)過何種路徑注入動物體內(nèi)未影響各組動物的體重情況，具有一定的生物安全性。動脈治療組的局部腫瘤溫度上升明顯，在三分鐘的時間內(nèi)局部溫度迅速升高到55℃左右，可以造成腫瘤細胞的大量壞死及凋亡，而其余對照組升溫效率較差，三分鐘內(nèi)升到28℃左右。

15、
　　在實驗結(jié)束后，我們把每一組的動物處死，取每一個組的心臟、肝臟、脾肺、腎臟等正常組織進行HE染色，未見明顯異常。同時我們?nèi)∶恳唤M的腫瘤組織，我們發(fā)現(xiàn)動脈治療組可見腫瘤組織的大量壞死，而其余組的腫瘤組織壞死較不明顯，動脈介入給藥后局部腫瘤組織內(nèi)的納米金殼含量增加，然后暴露腫瘤后給予近紅外激光照射治療可以大量殺死腫瘤組織，達到充分熱消融的目的。動脈治療組的腫瘤組織內(nèi)可見大量的腫瘤細胞壞死和凋亡，而靜脈組和其余對照組的壞死凋亡較少，

16、動脈治療組具有較明顯的深褐色顆粒染色，靜脈組和其余對照組未見明顯的caspase3和9的凋亡染色。各組之間進行統(tǒng)計比較發(fā)現(xiàn)，差異性明顯。在第三部分試驗中，我們改變了傳統(tǒng)的靜脈給藥的方式，通過介入手段進行給藥，提高腫瘤靶向性和光熱治療的效率。我們同樣分析了給藥后3、6、9、12和15天各組動物的血常規(guī)及生化指標的變化情況，未見明顯異常。
　　結(jié)論：
　　1、我們對pGSNs進行了活體動物的急性和亞慢性毒性研究，結(jié)果表明，pGS

17、Ns具有非常好的生物相容性。pGSNs經(jīng)靜脈注射重復(fù)7次后，5mg/kg不會引起動物明顯的損傷，而在25mg/kg和50 mg/kg時會引起肝臟、肺臟和腎臟的損傷，特別是在恢復(fù)期期間pGSNs表現(xiàn)出更明顯的毒性，說明pGSNs具有遲發(fā)的毒性效應(yīng)。
　　2、pGSNs在近紅外線激光的照射下可以有效的、快速的產(chǎn)生熱能，具有較高的產(chǎn)熱效率。pGSNs在近紅外線照射下可以有效的抑制腫瘤細胞的增值，促進腫瘤細胞的凋亡，且其具有良好的細胞安全