絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞系的建立及超聲輻照誘變效應(yīng)研究.pdf

1、絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino)為葫蘆科 Cucurbitaceae絞股藍(lán)屬Gynostemma多年生草質(zhì)藤本植物，是一種著名的中藥。它在我國(guó)分布廣泛，野生資源豐富。我國(guó)各地如廣東、福建、陜西、浙江、湖北、江西、安徽、四川、山東、河北等省已引種栽培成功。 超聲輻照屬于物理誘變?cè)矗c其他誘變?cè)聪啾?，具有方便廉價(jià)，綠色安全等優(yōu)點(diǎn)。它對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的影響。超聲輻照對(duì)染色體的致

2、畸作用，可以被利用，來進(jìn)行遺傳、育種方面的研究。目前，對(duì)超聲輻照誘變效應(yīng)的研究比較多，但其系統(tǒng)性、綜合性研究還不夠深入。因而，超聲輻照誘變與分子生物學(xué)技術(shù)、生物工程等其他育種途徑相互結(jié)合，進(jìn)一步加強(qiáng)機(jī)理和效應(yīng)等方面的研究，提高誘變效率是非常必要的。 本試驗(yàn)選取絞股藍(lán)作為材料，進(jìn)行了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)研究。并應(yīng)用懸浮細(xì)胞系作為誘變材料，引入了超聲輻照對(duì)目標(biāo)植物進(jìn)行誘變處理，綜合細(xì)胞工程與超聲輻照誘變方便快捷等特點(diǎn)，研究不同時(shí)間的超聲輻照

3、對(duì)絞股藍(lán)的影響，嘗試從形態(tài)特征、細(xì)胞和分子水平上揭示超聲輻照對(duì)絞股藍(lán)種子及懸浮細(xì)胞系的損傷效應(yīng)。主要的研究結(jié)果如下： 1.絞股藍(lán)種子萌發(fā)對(duì)溫度的適宜性較強(qiáng)，從4℃到35℃均可以發(fā)芽，在60℃和80℃的高溫處理中，有個(gè)別種子仍然能夠保持生活力。對(duì)不同級(jí)別種子發(fā)芽率的試驗(yàn)說明，大田收獲的絞股藍(lán)種子飽滿度不一，通過種子精選，可以增加種子萌發(fā)率，提高其使用價(jià)值。同時(shí)超聲處理絞股藍(lán)種子相對(duì)于6-BA、GA<,3>和2，4-D等3種處理方法

4、而言，可以有效提高發(fā)芽率，而且只有高劑量的超聲處理才會(huì)對(duì)絞股藍(lán)幼苗產(chǎn)生影響。處理后的植株沒有發(fā)生形態(tài)學(xué)方面的變異，對(duì)各個(gè)時(shí)期的生長(zhǎng)進(jìn)程也未見明顯變化。因此，可采用10min超聲處理，作為大規(guī)模播種的前處理，應(yīng)用于大田生產(chǎn)的前處理。 2.篩選出了適宜進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，質(zhì)地疏松且生長(zhǎng)旺盛的淡黃色愈傷組織，確定最佳懸浮培養(yǎng)基配比為：MS+2.4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L。置于25℃散射光或黑暗條件，100--120r/mi

5、n旋轉(zhuǎn)式搖床上震蕩培養(yǎng)，兩周后，在無菌條件下先用80目篩網(wǎng)濾去較大顆粒，再用100目濾取較小細(xì)胞團(tuán)。繼代培養(yǎng)獲得絞股藍(lán)細(xì)胞懸浮液。 3.使用不同的超聲時(shí)間梯度處理絞股藍(lán)根尖細(xì)胞，觀察染色體的變化。發(fā)現(xiàn)超聲輻照能夠引起絞股藍(lán)染色體畸變。產(chǎn)生的類型主要包括：微核、染色體斷片、染色體橋、落后染色體等。這種影響隨著超聲時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間超過30min，染色體畸變情況明顯加劇，在一個(gè)細(xì)胞里可能出現(xiàn)多種畸變類型。

6、4．使用不同的超聲時(shí)間梯度處理絞股藍(lán)懸浮細(xì)胞，懸浮細(xì)胞系生長(zhǎng)進(jìn)程變緩，需要經(jīng)過一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的適應(yīng)期之后才能進(jìn)入到細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。同時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)隨著超聲輻照時(shí)間的不同呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，而長(zhǎng)時(shí)間的超聲輻照處理則會(huì)造成細(xì)胞膜受損破裂，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 5．經(jīng)過超聲輻照的愈傷組織都多少能夠分化，說明絞股藍(lán)對(duì)超聲輻照是有一定程度的耐受性。而超聲輻照后的愈傷組織分化率則受到了不同程度的影響，這種影響和超聲輻照的時(shí)間呈正相關(guān)。短

7、時(shí)間的超聲輻照對(duì)愈傷組織的分化和再生植株的形態(tài)影響不大。而從8min超聲輻照開始，再生率明顯下降，部分愈傷組織出現(xiàn)褐化。同時(shí)使用超聲輻照和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及組織培養(yǎng)的方式，可以切實(shí)產(chǎn)生畸變，經(jīng)過超聲輻照過后的再生植株產(chǎn)生了一系列的變化，表現(xiàn)為分枝增多、葉片畸形、葉片變小、節(jié)間變短等。 6．我們利用RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs)方法，探討了超聲輻照對(duì)絞股藍(lán)再生植株DNA多態(tài)性的影響，電泳