IL-37b基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)DSS誘導(dǎo)的腸炎緩解作用的研究.pdf

1、目的：
　　白介素37b（IL-37b）具有顯著的免疫抑制功能，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）對(duì)炎癥性腸病具有緩解作用并且是理想的外源基因表達(dá)載體。本研究的目標(biāo)是觀察IL-37b基因修飾的小鼠MSC對(duì)葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的炎癥性腸病小鼠模型的緩解效果并探討發(fā)揮作用的機(jī)制。
　　方法：
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和免疫組化檢測(cè)潰瘍性結(jié)腸炎病人的病變腸組織中IL-37基因的mRNA和蛋白表達(dá)情況。構(gòu)建表達(dá)IL

2、-37b基因的腺病毒載體。C57BL/6小鼠致密骨片中分離培養(yǎng)MSC，流式細(xì)胞儀鑒定MSC表面標(biāo)記分子，油紅O和von Kossa染色鑒定MSC成脂成骨分化潛能。攜帶IL-37b基因的腺病毒轉(zhuǎn)染MSC后RT-PCR、western blot和ELISA鑒定IL-37b在MSC中的表達(dá)。C57BL/6小鼠飲用3％DSS連續(xù)8天，制備炎癥性腸病小鼠模型。在給于3%DSS的第一天，將小鼠隨機(jī)分為MSC-IL37b組(腹腔注射轉(zhuǎn)染IL-37b基

3、因的MSC)，MSC-eGFP組（腹腔注射轉(zhuǎn)染對(duì)照病毒的MSC），MSC組（腹腔注射未轉(zhuǎn)染病毒的MSC）和PBS組（腹腔注射PBS）。每日記錄小鼠體重和大便情況，第10天處死小鼠，取結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，H&E評(píng)估結(jié)腸炎癥嚴(yán)重程度；取小鼠脾臟，流式細(xì)胞儀分析脾臟單個(gè)核細(xì)胞中髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞（MDSCs，CD11b+Gr1+）和CD4+T細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs,CD4+CD25+Foxp3+）比例，細(xì)胞內(nèi)因子染色（ICS）分析CD

4、4+和CD8+T細(xì)胞炎癥因子表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　IL-37基因在潰瘍性結(jié)腸炎病人的病變組織中表達(dá)明顯增高，且其蛋白表達(dá)水平隨炎癥程度的增加而增加，提示其參與了整個(gè)疾病進(jìn)展過(guò)程。培養(yǎng)至P3時(shí)超過(guò)95%細(xì)胞表達(dá)典型的MSC表面標(biāo)記分子，且能成功分化為成脂和成骨細(xì)胞。IL-37b基因修飾的MSC分泌性表達(dá)IL-37b蛋白（13.03±1.023 ng/ml）。第10天處死小鼠，結(jié)果顯示：MSC-IL37b組的體重減少程度顯

5、著低于PBS組(85.74±2.01%vs.73.85±2.18%,P＜0.05)，PBS組與MSC組或MSC-eGFP組相比，體重減少趨勢(shì)更明顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(73.85±2.18% vs.80.36±2.28%P=0.07;73.85±2.18%vs.77.38±2.21%,P=0.28)；MSC-IL37b組(5.733±0.1706 cm)的平均結(jié)腸長(zhǎng)度顯著高于PBS組(4.375±0.2287 cm,P<0.001)、MSC

6、組(5.117±0.1078 cm,P<0.05)和MSC-eGFP組(4.967±0.1333 cm,P<0.01)，MSC組或MSC-eGFP組的結(jié)腸長(zhǎng)度都顯著高于PBS組（P<0.01,P<0.05）；病變腸組織的炎癥評(píng)分MSC-IL37b組(2.9±0.2449)顯著低于PBS組(5±0.4,P<0.01)、MSC組(3.9±0.3317,P<0.05)和MSC-eGFP組(4.2±0.3742,P<0.05)，MSC組顯著低于

7、PBS組(P<0.05)，MSC-eGFP組有低于PBS組的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0639)；在第10天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，MSC-IL37b組、MSC組和MSC-eGFP組無(wú)小鼠死亡，而PBS組的死亡率可達(dá)到66.7%，顯著高于其它各組；脾臟CD4+T細(xì)胞中Tregs的比例MSC-IL37b組(18.95±0.9919%)顯著高于MSC-eGFP組，(12.53±0.6977%,P<0.001)、MSC組(13.89±0.7742%,

8、P<0.01)和PBS組(10.10±0.8365%,P<0.0001)，MSC組顯著高于PBS組（P<0.05），但MSC-eGFP組和PBS組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；脾臟單個(gè)核細(xì)胞中MDSCs的比例MSC-IL37b組(4.843±0.1648%)顯著高于PBS組(2.693±0.4248%,P<0.01)和MSC-eGFP(3.103±0.2551%,P<0.05)，但與MSC組（3.643±0.3143%,P=0.112）之間的

9、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞內(nèi)因子染色結(jié)果顯示具有誘導(dǎo)Tregs分化功能的抑炎因子IL-2在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而促炎因子IFN-γ在CD4+和CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　IL-37b可能作為重要的抑炎因子參與了潰瘍性結(jié)腸炎的疾病進(jìn)展過(guò)程。IL-37b基因修飾的MSC能明顯緩解DSS誘導(dǎo)的腸炎小鼠模型的炎癥嚴(yán)重程度，其緩解作用優(yōu)于未進(jìn)行基因修飾的MSC，其機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)Treg和MDS