藥用植物金蕎麥懸浮體系的建立及其次生代謝物的生產(chǎn)調(diào)控.pdf

1、野生金蕎麥，亦稱(chēng)野蕎麥，天養(yǎng)麥，紅三七，多年生草本植物，系蓼科蕎麥屬中的一個(gè)種。是一種營(yíng)養(yǎng)豐富并具有重要藥用價(jià)值的資源植物，其主要的活性成分為黃酮類(lèi)化合物。然而，近些年由于自然環(huán)境的破壞、無(wú)計(jì)劃的采挖和栽培技術(shù)等原因，使得人類(lèi)對(duì)其的需求不斷增加，因此，應(yīng)用生物技術(shù)生產(chǎn)天然藥物具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)意義。 為了開(kāi)發(fā)中藥金蕎麥的新藥源，本文開(kāi)展了通過(guò)建立金蕎麥細(xì)胞懸浮系來(lái)生產(chǎn)黃酮類(lèi)物質(zhì)的研究。首先以金蕎麥的莖、葉等器官為外植體，在

2、四種含有6-BA和IBA不同激素配比的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織的形成，并從其中篩選類(lèi)黃酮含量最高的一種紅色細(xì)胞系作為懸浮培養(yǎng)的起始材料。然后，在9種含有6-BA和IBA不同激素配比的MS培養(yǎng)基上建立金蕎麥細(xì)胞懸浮系，篩選得到最適合金蕎麥懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的激素配比為MS+BA 1.0mg-L<'-1>+IBA 1.0mg·L<'-1>。測(cè)定獲得的懸浮系細(xì)胞生長(zhǎng)周期及類(lèi)黃酮合成動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)，二者呈緊密偶連，皆呈“S”型，生長(zhǎng)周期分為三個(gè)時(shí)期：延遲期

3、、指數(shù)期和靜止期。第12d金蕎麥細(xì)胞生長(zhǎng)到達(dá)曲線(xiàn)頂峰，此時(shí)，為最佳收獲期，即可同時(shí)獲最大的金蕎麥細(xì)胞生物量和類(lèi)黃酮產(chǎn)量． 同時(shí)研究了培養(yǎng)條件(接種量、碳源、氮源以及培養(yǎng)基上其他一些無(wú)機(jī)離子等)對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響，通過(guò)定期測(cè)定懸浮培養(yǎng)收獲的細(xì)胞鮮重及類(lèi)黃酮物質(zhì)的產(chǎn)量，篩選出適宜的培養(yǎng)條件。得到的最適合金蕎麥懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的條件為：以NH<,4><'+>和NO<,3>摩爾比例在20∶40～30∶30之間， 5.0mmol·L<'-1

4、>KH<,2>PO<,4>,0.5 mmol·L<'-1>CaCl<,2>·2H<,2>O， 1.5mmol·L<'-1>MgSO<,4>·7H<,2>O，0.2mmol·L<'1>FeSO<,4>·7H<,2>O，附加30g·L<'-1>的蔗糖改良的MS液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，激素配方為6-BA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L，配合每25ml培養(yǎng)液中接種鮮重1.2g的細(xì)胞。最適合金蕎麥懸浮細(xì)胞類(lèi)黃酮積累的培養(yǎng)條件為：以NH<'

5、+><,4>和NO<,3> 摩爾比例為30∶30，5.0mmol·L<'-1>KH<,2>PO<,4>,1.5mmol·L<'-1>CaCl<,2>·2H<,2>O，2.0mmolMgSO<,4>·7H<,2>O，0.15mmol·L<'-1>FeSO<,4>·7H<,2>O附加30g·L<'-1>的蔗糖改良的MS液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，激素配方為6-BA 1.0 mg/L+IBA1.0mg/L，配合每25ml培養(yǎng)液中接種鮮重0.8g的