凹葉厚樸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其次生代謝產(chǎn)物含量研究.pdf

1、凹葉厚樸( Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var. biloba Rehd.et Wils)是我國(guó)特有的珍貴樹種。厚樸用途廣，但是資源稀缺。由于人為盲目砍伐，厚樸資源急劇減少，現(xiàn)已被列入國(guó)家三級(jí)珍稀瀕危保護(hù)植物。植物細(xì)胞培養(yǎng)被認(rèn)為是解決資源危機(jī)的理想途徑。其特點(diǎn)是在完全人工控制的條件下進(jìn)行，不受地區(qū)、季節(jié)、土壤及有害生物的影響，且生產(chǎn)周期較短，可通過選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系和改善培養(yǎng)條件獲得超過傳統(tǒng)植物栽培

2、所得的代謝產(chǎn)物。本試驗(yàn)通過對(duì)厚樸愈傷組織培養(yǎng)的條件進(jìn)行優(yōu)化和建立厚樸細(xì)胞懸浮體系，并對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)合成進(jìn)行研究，為進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)生產(chǎn)厚樸藥用成分提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.通過對(duì)基本培養(yǎng)基、外植體、激素濃度及組合進(jìn)行篩選，找到了最適合厚樸愈傷組織誘導(dǎo)的條件。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)這三者均對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有顯著的影響。B5、MS、1/2MS三種基本培養(yǎng)基中 B5誘導(dǎo)率最高；頂芽、莖、葉3種外植體均可誘導(dǎo)出愈傷組織，莖段

3、誘導(dǎo)率最高，其愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)91.67％，頂芽次之，葉片最低，綜合考慮分析得出，頂芽為最佳外植體；最佳誘導(dǎo)激素組合為3.0 mg· L-12,4-D+1.0 mg· L-16-BA，愈傷組織誘導(dǎo)在90%以上。
　　2.將生長(zhǎng)旺盛且長(zhǎng)勢(shì)一致的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，探討NAA與6-BA組合濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響。當(dāng)繼代培養(yǎng)基為B5+2.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-16-BA時(shí)，愈傷組織增殖效果最好，增殖倍數(shù)達(dá)2.8

4、65倍。當(dāng)NAA濃度大于3.0 mg·L-1時(shí)，會(huì)抑制愈傷組織的繼代培養(yǎng)；當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織的平均增殖倍數(shù)僅為1.202倍，且生長(zhǎng)狀態(tài)較差，顏色深暗，松軟。
　　3.以頂芽愈傷組織建立了懸浮系，研究蔗糖濃度、搖床轉(zhuǎn)速、接種密度及裝液量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。研究結(jié)果表明，蔗糖濃度為30 g·L-1最適合厚樸細(xì)胞生長(zhǎng)，最佳搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，當(dāng)接種密度為1.0:20時(shí)，懸浮細(xì)胞增長(zhǎng)量最高，最適裝液量

5、為30 mL；
　　4.本試驗(yàn)研究了激素濃度組合、pH值、2種前體物質(zhì)和光質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和總酚含量的影響，研究結(jié)果表明，最適合厚樸細(xì)胞生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的激素組合是：NAA0.5 mg·L-1+2,4-D0.5 mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1+KT1.5 mg·L-1；培養(yǎng)厚樸細(xì)胞及其次生代謝產(chǎn)物的最佳pH值是pH6.5；D,L,β-苯丙氨酸0.1 mg·L-1+L-苯丙氨酸0.5 mg·L-1的前體組合能夠大大促進(jìn)

6、細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的積累；黃光最有利于懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)，但細(xì)胞中總酚含量較低，藍(lán)光下的細(xì)胞干重增長(zhǎng)率僅次于黃光試驗(yàn)組，且總酚含量最高，是對(duì)照組的3.19倍，綜合分析得出藍(lán)光為培養(yǎng)厚樸懸浮細(xì)胞的最佳光質(zhì)。在激素、pH、前體物質(zhì)和光質(zhì)這四個(gè)影響因子中，光質(zhì)對(duì)厚樸細(xì)胞次生代謝的影響程度較其他三者大，前三者細(xì)胞最高總酚含量均在0.200%左右，而在光質(zhì)試驗(yàn)中，最高總酚含量能達(dá)到0.423%。
　　5.細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈“S”型，細(xì)胞周期