杜仲細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的研究.pdf

1、杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)單科、單屬、單種，是中國特有的名貴經(jīng)濟樹種，也是我國傳統(tǒng)的珍貴藥材，具有補肝腎、強筋骨、降血壓、抗衰老、抗腫瘤等功效。千百年來，杜仲皮作為中藥在人們醫(yī)療保健等方面起著十分重要的作用。其中的綠原酸和桃葉珊瑚苷有廣泛的藥理作用，具有抗菌消炎、抗癌、抗艾滋病、保肝利膽、抗氧化劑和抑制自由基的功效，具有廣闊的藥用市場。 杜仲作為國家二級保護植物，在現(xiàn)有資源被充分利用的基礎(chǔ)上，也需要得

2、到應(yīng)有的保護。因此，實現(xiàn)杜仲細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸和桃葉珊瑚苷是保證今后市場需求的手段之一。本論文主要研究了杜仲愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖、杜仲細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立、綠原酸和桃葉珊瑚苷積累的代謝調(diào)控，取得了如下的研究結(jié)果： 1．在無菌苗的培育過程中，選用冰箱4-7℃保藏的種子，使用0.1％升汞溶液消毒10 min，平置方式接種的出芽率最高。 2．比較了田間葉片、無菌苗的子葉和真葉等不同外植體，發(fā)現(xiàn)無菌苗真葉出愈率最高。在培

3、養(yǎng)基及pH的選擇上，選用B5培養(yǎng)基，pH 6.3，誘導(dǎo)愈傷組織效果最好。在2,4-D、NAA、6-BA這三種激素中，最適合誘導(dǎo)愈傷組織的激素是1.0 mg/L2,4-D，NAA的誘導(dǎo)率低于2,4-D，且在后期出現(xiàn)分化現(xiàn)象，而6-BA完全不能誘導(dǎo)出愈傷組織。 3．杜仲愈傷組織的生長曲線大致呈S形，培養(yǎng)周期為15 d，最適繼代時間是12～15 d。在50mL三角瓶中，杜仲愈傷組織接種量控制在0.35g鮮重左右比較合適。作為碳源，25

4、g/L蔗糖對愈傷組織的增殖效應(yīng)最好。最適合繼代的培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基，pH為6.3。當(dāng)2,4-D濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織生長最旺盛，增長率最大。在此基礎(chǔ)上添加NAA和6-BA，發(fā)現(xiàn)NAA的添加降低了愈傷組織的增長率，而6-BA的添加提高了愈傷組織的增長率，最適濃度為0.5 mg/L。 4．杜仲細胞的培養(yǎng)周期為15 d，而桃葉珊瑚苷的含量在第18 d最高。50 g/L鮮重接種量是最適接種量。20 g/L蔗糖作為碳源最合適。

5、最適宜桃葉珊瑚苷積累的懸浮培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH 5.8。最適合桃葉珊瑚苷積累的單個激素是2.0mg/L2,4-D，激素組合是2.0 mg/L2,4-D+0.5 mg/L6-BA。100 mg/L水解酪蛋白最有利于桃葉珊瑚苷的積累，酵母提取物濃度為15 mg/L時，桃葉珊瑚苷的含量最高。 5．綠原酸的含量在第15 d達到最高。35 g/L蔗糖作為碳源最合適。最適宜綠原酸積累的懸浮培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH 5.3。最適合綠原酸積