螢光素酶報告基因檢測法初步探究甲狀腺腫瘤與女性體內(nèi)孕激素水平關(guān)系.pdf

1、甲狀腺腫瘤是一種常見的頸部腫瘤，其發(fā)病率女性明顯高于男性，因而很多學者認為這種差異性很可能與男女體內(nèi)性激素水平有關(guān)。孕激素是一種雌性激素，主要在生殖、發(fā)育系統(tǒng)上發(fā)揮作用。但是隨著孕激素類藥物被廣泛應用在醫(yī)療、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)等上，給社會帶來巨大貢獻的同時，也給環(huán)境帶來了嚴重的激素污染，已經(jīng)開始影響到生物體自身的內(nèi)分泌系統(tǒng)。孕激素受體（Progesterone receptor,PR）屬于核受體，只有當PR被孕激素激活后才能結(jié)合到孕激素受體應

2、答元件的DNA區(qū)域，從而啟動受體應答元件下游靶基因的表達。本課題利用這種機制并將螢光素酶報告基因克隆到受體應答元件下游，從而建立了一種高靈敏度、高通量的可用于孕激素水平生物檢測的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，并將其應用于甲狀腺相關(guān)腫瘤病人血液中的孕激素類物質(zhì)水平的檢測分析，以期探究孕激素類物質(zhì)與甲狀腺腫瘤發(fā)生的關(guān)聯(lián)性。
　　本研究共構(gòu)建了含有孕激素受體基因的3種不同表達載體和3種含有不同串聯(lián)倍數(shù)的孕激素受體應答元件片段的載體，通過螢光素酶的活性分析

3、，利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)將活性最高的一對重組質(zhì)粒pEGFP-N2-hPR/pGL4-PRE4轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中，然后經(jīng)過抗生素篩選和有限稀釋法挑選出10個單克隆細胞株。再利用分子克隆技術(shù)、亞細胞定位技術(shù)鑒定出陽性單克隆細胞株。
　　從第5代到第23代細胞的螢光素酶活性的檢測結(jié)果表明該細胞株具有較強的遺傳穩(wěn)定性和較高的靈敏度，其檢出限可以達到10 pM。因此，該穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株與螢光素酶活性檢測技術(shù)結(jié)合起來即建立孕激素檢測分析系統(tǒng)。同時，還

4、觀察到細胞株的螢光素酶活性隨著外界環(huán)境中孕激素濃度的升高而增強，但是濃度高于106 pM孕激素反而會降低螢光素酶活性甚至是引起細胞死亡，這也可以說明環(huán)境中孕激素長期污染能給動物和人類健康造成危害，人類應該更加高度重視環(huán)境激素污染問題。
　　為了研究孕激素水平和女性甲狀腺腫瘤高發(fā)率之間的關(guān)聯(lián)性，本研究利用孕激素受體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株檢測分析系統(tǒng)對甲狀腺相關(guān)腫瘤疾病的女性患者血清中孕激素水平進行檢測分析。經(jīng)過生物統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌病人

5、的血清中孕激素水平低于與正常人血清中孕激素水平，并且有26.7％甲狀腺腫瘤病人血清種孕激素平均水平低于1 nM，而正常組血清孕激素平均水平都高于1 nM；正常組中有22.7%樣品的孕激素水平超過50 nM，而甲狀腺腫瘤組中卻沒有。通過差異性分析顯示甲狀腺腫瘤組和正常組的孕激素水平存在顯著性差異。盡管女性體內(nèi)孕激素水平的波動較大，但本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺腫瘤患者血液中的孕激素水平明顯低于正常人血液中孕激素水平，提示在一定范圍內(nèi)甲狀腺腫瘤患者腫瘤