小鼠哮喘模型Rac1水平的改變及其與ILC2相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　通過建立小鼠哮喘模型，檢測Rac1在小鼠哮喘模型前后相關(guān)組織中表達(dá)水平的改變情況，并分析Rac1與2型固有淋巴細(xì)胞（ILC2）相關(guān)細(xì)胞因子如IL-5、IL-33、IL-13表達(dá)的關(guān)系，觀察其對氣道炎癥的影響，探討Rac1調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)類型和參與哮喘病理損傷的可能機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究哮喘病的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，拓展哮喘病臨床干預(yù)的新思路。
　　方法：
　　1.卵清蛋白（OVA）哮喘模型的建立：哮喘建模參照文

2、獻(xiàn)并稍加改進(jìn)，即實驗組小鼠在第1d和第11d分別腹腔注射50μg OVA和10％氫氧化鋁佐劑，對照組注射相等量的生理鹽水(NS)，第22d開始實驗組各小鼠給予霧化吸入2%的OVA與生理鹽水的混合溶液,激發(fā)小鼠的I型超敏反應(yīng),1次1小時,每天霧化1次、一連5d。同時，正常組小鼠給予吸入相等的NS。
　　2. Rac1抑制劑（EHT1864）干預(yù)試驗：在建模過程中，于霧化前三天連續(xù)給小鼠腹腔注射EHT1864，其他步驟同上述哮喘模型建

3、立。EHT1864粉劑在使用前用生理鹽水溶解并充分混勻，用藥量為40mg\kg。
　　3.定量-PCR檢測mRNA：取小鼠支氣管肺泡灌洗、外周血單個核細(xì)胞，經(jīng)離心獲得細(xì)胞沉淀；取左邊肺組織，充分剪碎研磨得到組織懸液。于上述細(xì)胞或組織懸液加入Trizol以裂解細(xì)胞并獲取總RNA，然后再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。繼而做實時熒光定量PCR，檢測Rac1及ILC2相關(guān)細(xì)胞因子（IL-5, IL-33和IL-13） mRNA的表達(dá)。

4、>　　4.酶聯(lián)免疫吸附試驗：取小鼠的支氣管肺泡灌洗液（BALF）或眼球外周血，經(jīng)離心后得到灌洗液上清和外周血血清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法檢測ILC2相關(guān)的細(xì)胞因子（IL-5, IL-33和IL-13）蛋白表達(dá)水平。
　　5.組織切片病理觀察：取小鼠右肺組織置于福爾馬林中經(jīng)固定、石蠟包埋等一系列過程制成切片，蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察病理表現(xiàn)。
　　6.熒光抗體染色：取小鼠支氣管置于福爾馬林中經(jīng)固定、石

5、蠟包埋等一系列過程制作成石蠟切片，再用直接法進(jìn)行免疫熒光抗體染色，檢測支氣管中Rac1的表達(dá)情況。
　　7.采用Graph Pad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析：對哮喘小鼠肺組織Rac1和細(xì)胞因子（IL-5, IL-33和IL-13）的表達(dá)水平進(jìn)行直線相關(guān)分析，組間均數(shù)比較采用兩樣本非配對T檢驗,相關(guān)性分析選用Pearson法，P<0.05，表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義，多組間的統(tǒng)計分析采用0ne-way ANOVA，P<0.05，表明差

6、異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.通過哮喘模型制作過程對小鼠的觀察可見，哮喘組小鼠表現(xiàn)為煩躁不安,出現(xiàn)頻繁瘙癢的行為，同時還伴有呼吸加深加快、打噴嚏、大小便失禁、擤鼻等典型的哮喘表現(xiàn)，而對照組無明顯異常表現(xiàn)。
　　2.肺組織病理觀察結(jié)果:HE染色顯微鏡下可見，哮喘組小鼠肺泡間及周圍小血管出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞，如嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、氣道內(nèi)杯狀細(xì)胞肥大增生、血清總IgE及OVA-IgE含量均高于對照組。而對照組小鼠可見，肺組

7、織氣道結(jié)構(gòu)清晰、氣管周圍無細(xì)胞浸潤、炎癥性改變不明顯。
　　3.免疫熒光分析表明：哮喘模型小鼠Rac1的水平與正常小鼠相比顯著下降， EHT1864干預(yù)后，Rac1的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。
　　4.定量RT-PCR分析結(jié)果：哮喘小鼠肺組織或肺泡灌洗液Rac1 mRNA表達(dá)水平均明顯低于正常對照組，使用EHT1864干預(yù)后，Rac1水平則進(jìn)一步降低。
　　5.小鼠肺組織表達(dá)ILC2相關(guān)細(xì)胞因子的檢測：通過分析模型組與正常組目的

8、基因mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，哮喘小鼠肺組織的IL-5、IL-33和IL-13的水平與正常組小鼠相比均顯著增高；EHT1864處理組的IL-5、IL-33和IL-13的水平上調(diào)尤為顯著。此結(jié)果表明Rac1的降低與ILC2相關(guān)細(xì)胞因子水平的升高存在著緊密的聯(lián)系。
　　6. ELISA檢測外周血上清IL-5、IL-33和IL-13蛋白表達(dá)水平的結(jié)果表明，哮喘模型組小鼠上述細(xì)胞因子水平均高于對照組。
　　7.分析肺組織中Rac1

9、與IL-5、IL-33和IL-13mRNA表達(dá)水平關(guān)系的相關(guān)性結(jié)果顯示，哮喘小鼠肺組織Rac1的mRNA水平與IL-5、IL-33和IL-13的mRNA水平均顯示明顯的負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　在哮喘小鼠，IL-5、IL-33和IL-13的mRNA和蛋白表達(dá)水平與對照組相比都顯著增高，同時Rac1的表達(dá)卻顯著下降。相關(guān)性分析表明Rac1和ILC2s相關(guān)細(xì)胞因子(IL-5,IL-33，IL-13)之間存在顯著地負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一