基于BDNF介導(dǎo)的P13K-AKT信號(hào)通路補(bǔ)腎活血方藥對(duì)血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、目的:血管性癡呆(VD)是指由一系列腦血管因素引起的，在腦組織損害基礎(chǔ)上產(chǎn)生的以高級(jí)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙為主的臨床綜合征。中醫(yī)認(rèn)為，腎精漸虧，腦髓空虛，瘀血阻絡(luò)為本病的基本病機(jī)，治療當(dāng)以補(bǔ)腎活血為基本治法。前期研究表明，補(bǔ)腎活血方藥可促進(jìn)血管性癡呆小鼠腦組織BDNF mRNA的表達(dá)，提高腦組織BDNF含量，改善學(xué)習(xí)記憶能力，但該藥通過BDNF介導(dǎo)的何種信號(hào)通路發(fā)揮作用尚不清楚。本課題通過觀察補(bǔ)腎活血方藥對(duì)VD大鼠行為學(xué)、腦海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

2、，以及BDNF、TrkB、PI3K、AKT等指標(biāo)表達(dá)的影響，從調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路角度揭示補(bǔ)腎活血方藥誘導(dǎo)BDNF表達(dá)、保護(hù)神經(jīng)元的作用機(jī)制。
　　方法:清潔級(jí)雄性SD大鼠75只，體重約250-300g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，運(yùn)用水迷宮實(shí)驗(yàn)剔除不合格大鼠，剩余70只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平對(duì)照組、補(bǔ)腎活血高劑量組、補(bǔ)腎活血低劑量組，每組各14只。
　　SD大鼠術(shù)前12小時(shí)

3、禁食，4小時(shí)禁水，用10％水合氯醛（3.5ml/kg體重）腹腔注射麻醉大鼠。依據(jù)文獻(xiàn)，予以常規(guī)消毒，頸部正中切口，鈍性分離肌肉及結(jié)締組織，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并用4號(hào)絲線結(jié)扎，逐層縫合肌肉和皮膚，縫合后于傷口局部皮下注射慶大霉素0.2萬單位預(yù)防傷口感染，假手術(shù)組分離雙側(cè)頸動(dòng)脈，但不結(jié)扎。
　　各藥物治療組在造模術(shù)后第3天按體重比例進(jìn)行給藥干預(yù)，補(bǔ)腎活血高劑量組以10.14g生藥/kg體重的劑量灌服補(bǔ)腎活血方藥液，補(bǔ)腎活血低劑量組以5.

4、07g生藥/kg體重灌服補(bǔ)腎活血方藥液，尼莫地平對(duì)照組以11.06mg/kg濃度灌服尼莫地平藥液。假手術(shù)組、模型組均以10ml/kg體重灌服生理鹽水，每日1次，治療天數(shù)為30d。造模及給藥結(jié)束后剔除死亡大鼠，各組剩余只數(shù)分別為:假手術(shù)組12只，模型組11只，補(bǔ)腎活血高劑量組12只，補(bǔ)腎活血低劑量組11只，尼莫地平對(duì)照組11只。
　　治療30d后，每組隨機(jī)抽取3只大鼠處死，剝離大鼠腦海馬，放入4％戊二醛中固定，H-7500型透射電子

5、顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化，照相并記錄鏡下圖片結(jié)果。其余大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，主要包括定位航行實(shí)驗(yàn)、空間探索實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠斷頭取腦，western blot檢測(cè)大鼠BDNF、TrkB、PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平，RT-qPCR(Real-time quantitive PCR)法檢測(cè)大鼠BDNF、TrkB、PI3K、AKT的mRNA表達(dá)。
　　本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±

6、s）表示，用SPSS forWindows16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，比較采用單因素方差分析，然后用leastsignificant difference進(jìn)行組間比較，顯著性差異水平以0.05和0.01為標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.1定位航行實(shí)驗(yàn)
　　與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。尼莫地平組、補(bǔ)腎活血低劑量組與補(bǔ)腎活血高劑量組相比，大鼠逃避潛伏期無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01)。
　　1.2空間探索實(shí)驗(yàn)
　　與假手術(shù)組相比，模型組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)及在原平臺(tái)停留時(shí)間均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)及在原平臺(tái)停留時(shí)間均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。與補(bǔ)腎活血高劑量組相比，補(bǔ)腎活血低劑

8、量組和尼莫地平組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)及在原平臺(tái)停留時(shí)間均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　2各組大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的觀察
　　假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞器豐富，胞核大呈橢圓形，核膜完整，常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)較少。模型組:神經(jīng)元嚴(yán)重水腫，細(xì)胞器數(shù)量顯著減少，線粒體大部分嵴和部分膜融合、模糊不清，嵴有斷裂和缺失現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有明顯的顆粒融合或脫顆?，F(xiàn)象。補(bǔ)腎活血高劑量組:神經(jīng)元輕度水腫，線粒體部

9、分嵴和膜融合，模糊不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)顆粒融合、脫顆?，F(xiàn)象。突觸小泡減少，突觸間隙融合。補(bǔ)腎活血低劑量組和尼莫地平組超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)接近，均可見神經(jīng)元水腫，細(xì)胞器數(shù)量減少，線粒體大部分嵴和部分膜融合、模糊不清，嵴有斷裂和缺失現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有明顯的顆粒融合或脫顆?，F(xiàn)象。
　　3各組大鼠腦海馬BDNF、TrkB、PI3K、AKT蛋白表達(dá)量的變化
　　與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦海馬BDNF和TrkB蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

10、義（P＜0.05或P＜0.01），經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組大鼠腦海馬BDNF和TrKB蛋白表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與補(bǔ)腎活血高劑量組相比，補(bǔ)腎活血低劑量組和尼莫地平對(duì)照組BDNF和TrKB蛋白表達(dá)均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。
　　與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦海馬PI3K和AKT蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組大鼠腦海馬PI3K和AKT

11、蛋白表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與補(bǔ)腎活血高劑量組相比，補(bǔ)腎活血低劑量組和尼莫地平對(duì)照組PI3K和AKT蛋白表達(dá)均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。
　　4各組大鼠腦海馬BDNFmRNA、TrkBmRNA、PI3KmRNA、AKTmRNA表達(dá)相對(duì)含量的變化
　　與假手術(shù)組相比，模型組TrkBmRNA表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組大鼠腦海馬B

12、DNFmRNA和TrkBmRNA表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。與補(bǔ)腎活血高劑量組相比，補(bǔ)腎活血低劑量組和尼莫地平對(duì)照組BDNFmRNA表達(dá)均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);尼莫地平對(duì)照組TrkBmRNA表達(dá)有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　與假手術(shù)組相比，模型組PI3KmRNA和AKTmRNA表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);經(jīng)

13、藥物干預(yù)后，各治療組大鼠腦海馬PI3KmRNA和AKTmRNA表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。與補(bǔ)腎活血高劑量組相比，補(bǔ)腎活血低劑量組和尼莫地平對(duì)照組PI3KmRNA表達(dá)均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　腦海馬區(qū)缺血缺氧是導(dǎo)致VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退的重要原因。腦缺血后海馬區(qū)BDNF水平降低，受體TrKB表達(dá)下降，以致其介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路障礙，加重對(duì)腦

14、海馬神經(jīng)元的損傷，引起學(xué)習(xí)記憶功能受損。本研究結(jié)果表明:
　　1補(bǔ)腎活血方藥能夠減輕缺血對(duì)腦海馬神經(jīng)元的損傷，改善神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
　　2補(bǔ)腎活血方能夠從基因和蛋白水平調(diào)節(jié)大鼠海馬BDNF和TrkB的表達(dá)，激發(fā)下游通路對(duì)神經(jīng)元修復(fù)保護(hù)作用。
　　3補(bǔ)腎活血方能夠調(diào)控BDNF介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路，減輕神經(jīng)元缺血損傷。
　　4“腎藏精”，精氣具有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育作用，與BDNF