中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源的IL-33在實驗性自身免疫性腦脊髓炎中的作用.pdf

1、背景：
　　IL-1家族的新成員白介素-33（Interleukin-33，IL-33）既可作為核因子發(fā)揮轉錄抑制的作用，又具有細胞因子的信息傳遞功能。除了在細胞受損時被動釋放至胞外，IL-33能否主動釋放目前尚不清楚。IL-33在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）的多種細胞核內(nèi)組成性高表達，被證明與 CNS最常見的自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥/實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Multiple scler

2、osis/ Experimental autoimmune encephalomyelitis，MS/EAE）具有相關性，但 CNS中的IL-33的釋放特征及其對MS/EAE疾病進展的作用遠未闡明。
　　目的：
　　闡明EAE病程中CNS中的IL-33的釋放特征及對EAE疾病進展的作用，為探討IL-33可能的生理學和病理學意義提供依據(jù)，并為治療MS提供新的生物學靶標。
　　方法：
　　一、體內(nèi)實驗
　　1．

3、用 C57BL/6小鼠制備 EAE動物模型，根據(jù) EAE的臨床癥狀和疾病的發(fā)展趨勢將EAE病程分為發(fā)病前期（Pre-onset）、初期（Onset）、高峰期（Peak）和慢性期（Chronic）四期，以正常的、未經(jīng)任何處理（Naive）的C57BL/6小鼠為對照。在EAE病程的相應時間點取材并進行以下檢測：
　?。?）EAE各期脊髓組織中IL-33的表達變化：Western Blot檢測總蛋白水平，免疫組化檢測胞內(nèi)蛋白的水平，EL

4、ISA檢測脊髓組織勻漿液、釋放到腦脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）和血清中的水平，ELISA同時還檢測可溶性ST2（sST2）以及IL-1β、IL-17A和TNF-α等炎癥相關細胞因子水平的變化。
　　（2）脊髓組織中IL-33及ST2的細胞定位：免疫熒光染色檢測Naive小鼠脊髓組織切片中IL-33、ST2與星形膠質(zhì)細胞（GFAP標記）、小膠質(zhì)細胞（CD11b標記）以及神經(jīng)元（NeuN標記）的共定位情況，并

5、檢測EAE各期IL-33和IL-33陽性細胞的熒光強度的變化。
　　2．利用小鼠腦定位儀將C57BL/6小鼠進行側腦室埋管，放置7天小鼠創(chuàng)傷愈合后再進行EAE造模，并于造模后的第10~20天從埋入側腦室的導管給予IL-33 mAb處理，2μg/次/只，隔天給藥。以同型抗體IgG2a和PBS組為對照。同時對小鼠EAE發(fā)病的臨床癥狀進行評分，并于EAE高峰期（造模后第19天）取材進行以下檢測：
　　（1）檢驗IL-33 mAb中

6、和IL-33的效果：Western Blot檢測脊髓組織中IL-33的總蛋白水平，組化檢測脊髓切片中胞內(nèi) IL-33的水平，ELISA檢測脊髓組織勻漿液的IL-33、sST2的水平。
　　（2）檢驗IL-33 mAb處理對CNS的影響：LFB染色檢測脊髓髓鞘脫失情況，免疫組化染色檢測星形膠質(zhì)細胞（GFAP標記）、小膠質(zhì)細胞（CD11b標記）的增殖活化以及神經(jīng)元（NeuN標記）的數(shù)量變化；ELISA檢測脊髓組織勻漿液的TNF-α、H

7、MGB1等炎癥相關細胞因子的水平。
　　（3）檢測IL-33 mAb處理對T細胞亞群的影響：脊髓切片CD3免疫組化染色檢測浸潤到 CNS的T淋巴細胞水平；流式細胞術檢測脾臟、腹股溝和腋窩引流淋巴結Th1/17型細胞亞群的變化。
　　二、體外實驗
　　1．IL-33在原代CNS細胞中的表達：分離培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元，Western Blot分別檢測IL-33在原代星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元胞漿-胞核蛋白中的表達。

8、>　　2．IL-33主動釋放：
　?。?）培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細胞，分別用脊髓組織勻漿液（Naive、Pre-onset和Peak期）、TNF-α聯(lián)合 ATP處理細胞，用超濾管濃縮法將刺激后的培養(yǎng)上清濃縮10倍后，ELISA檢測IL-33的水平，Western Blot檢測細胞裂解液中IL-33的含量，臺盼藍活細胞拒染法檢測細胞的生存率，GFAP熒光染色檢測星形膠質(zhì)細胞的活化。
　?。?）培養(yǎng)人星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞系 U87細胞

9、，用免疫熒光染色確定 U87細胞表達IL-33后，用PTX和/或ATP處理細胞，用超濾管濃縮將刺激后的培養(yǎng)上清濃縮10倍后，ELISA檢測濃縮上清中IL-33的水平，臺盼藍活細胞拒染法檢測細胞的生存率。
　　3．EAE高峰期釋放的IL-33對膠質(zhì)細胞功能的調(diào)控：
　　（1）對原代星形膠質(zhì)細胞的作用：用EAE高峰期脊髓組織勻漿液（含有高水平IL-33）處理細胞，再加入IL-33 mAb中和IL-33，MTT檢測細胞的增殖，GF

10、AP熒光染色檢測星形膠質(zhì)細胞的活化。
　?。?）對小膠質(zhì)細胞系BV2細胞的作用：用EAE高峰期脊髓組織勻漿液（含有高水平IL-33）處理細胞，再加入IL-33 mAb中和IL-33，MTT檢測細胞的增殖，NO檢測反映細胞的活化；熒光微球吞噬實驗檢測吞噬功能。然后用 LPS模擬炎癥微環(huán)境激活BV2細胞，再用重組IL-33干預LPS激活的細胞并進行以上檢測加以佐證。
　　結果：
　　1．IL-33在EAE進展中被釋放到脊髓

11、組織局部：在Pre-onset、Onset和Peak期脊髓組織胞核內(nèi)IL-33表達減少，而IL-33總蛋白并未減少，Chronic期胞核內(nèi)IL-33和IL-33總蛋白均顯著增加；ELISA檢測發(fā)現(xiàn)脊髓組織勻漿上清從 Pre-onset期開始即有 IL-33釋放，Peak期釋放水平最高；但血清和 CSF中未檢測到 IL-33；此外，脊髓組織勻漿液中的TNF-α和IL-17A等炎癥相關細胞因子的水平也有所增加。
　　2．脊髓組織定居細

12、胞表達 IL-33和其受體 ST2：在正常小鼠脊髓組織中，IL-33不僅定位在星形膠質(zhì)細胞的胞核中，而且還表達在神經(jīng)元的胞核和胞漿中；提取原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的胞漿-胞核蛋白進行Western Blot檢測 IL-33進一步證實了這點。ST2主要由星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞表達。
　　3．IL-33釋放的來源：
　?。?）IL-33可能被神經(jīng)元被動釋放：在EAE進展中，胞內(nèi)IL-33的減少與神經(jīng)元的損傷正相關。

13、>　?。?）IL-33被星形膠質(zhì)細胞主動釋放：在EAE進展中，胞內(nèi)IL-33的減少與星形膠質(zhì)細胞的激活負相關。體外實驗進一步證明在炎癥刺激如脊髓組織勻漿液和 ATP能誘導原代星形膠質(zhì)細胞活化并主動釋放IL-33；TNF-α也能誘導原代星形膠質(zhì)細胞活化并主動釋放IL-33，而且這種釋放不需依賴ATP；EAE造模試劑PTX和/或ATP刺激也能誘導U87細胞主動釋放IL-33。
　　4．CNS局部給予IL-33 mAb處理加重EAE：E

14、AE發(fā)病期側腦室給予IL-33 mAb處理，EAE的臨床癥狀、CNS的組織損傷（脫髓鞘）、T淋巴細胞浸潤和炎癥加重；同時，星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞活化增加，而外周 Th1/17細胞的比例和數(shù)量不受影響。
　　5．EAE高峰期釋放的IL-33調(diào)控膠質(zhì)細胞的功能：
　?。?）IL-33抑制星形膠質(zhì)細胞的增殖。
　?。?）IL-33抑制小膠質(zhì)細胞的增殖和活化，同時促進其吞噬功能。
　　結論：
　　1．在正常小鼠脊

15、髓組織中，IL-33主要由星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元表達；ST2主要由星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞表達。
　　2．在EAE進展中，受損神經(jīng)元可能被動釋放IL-33，激活的星形膠質(zhì)細胞主動釋放IL-33到脊髓組織局部，以旁分泌或自分泌的方式發(fā)揮作用。
　　3．CNS局部給予IL-33 mAb處理加重EAE。
　　4．EAE高峰期釋放的IL-33抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的增殖、活化，同時促進小膠質(zhì)細胞的吞噬功能。
　　綜上