sla-lp基因敲除鼠模型的建立;sla-lp啟動子的鑒定及其特點(diǎn).pdf

1、[研究背景]自身免疫性肝炎(AIH)是三種自身免疫性肝臟疾病之一，在各種族、年齡段和性別均有發(fā)病，以女性和兒童多見。AIH病人對免疫抑制治療的反應(yīng)非常好，但是，如果不及時治療，則預(yù)后比較差(Krawitt 1996)。因此，該病預(yù)后的關(guān)鍵是早期正確的診斷。然而，目前尚沒有一項理想的、特異性實(shí)驗室診斷指標(biāo)。其診斷須結(jié)合血清學(xué)檢查(高IgG)、肝活檢、臨床表現(xiàn)及非特異性自身抗體(ANA、SMA、pANCA和LKM等)的存在進(jìn)行綜合判斷。在所

2、有的AIH病人中，約20﹪的病人出現(xiàn)抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(抗-SLA/LP)抗體，這是目前唯一的一項具有100﹪特異性的實(shí)驗室指標(biāo)(Wies et al.2000)。 可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)是一種可溶性細(xì)胞漿蛋白，分子量約50kDa，在體內(nèi)各組織中包括胚胎中廣泛表達(dá)，但在肝、胰、腎、肺等酶代謝活躍的器官高表達(dá)，活化的T細(xì)胞也過量表達(dá)，推測其可能為一種或一組酶(Wies et al.2000)。另有研究指出，

3、SLA與UGA serine tRNA-protein complex有關(guān)，可能是硒代半胱氨酸代謝途徑的重要一員(Costa et al.2000)。SLA/LP的化學(xué)本質(zhì)和生物學(xué)功能直到最近才被實(shí)驗證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，SLA/LP蛋白是真核生物和古生菌中硒蛋白合成過程中的一個關(guān)鍵酶一磷酸絲氨酰-tRNA：硒代半胱氨酰-tRNA合成酶，催化磷酸絲氨酰-tRNA轉(zhuǎn)化為硒代半胱氨酰-tRNA，從而將用于蛋白質(zhì)合成的第21種氨基酸～硒代半胱氨酸運(yùn)

4、輸?shù)胶颂求w，合成硒蛋白(Chambers et al.1986；Zinoni et al.1986；Yuan etal.2006；Xu et al.2007)。目前，對SLA/LP蛋白的表達(dá)調(diào)控知之甚少，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表；同時對sLA/LP蛋白在AIH中的自身免疫作用機(jī)理也不清楚。因此，如果對sLA/LP了解的多一些，對明白SLA/LP的自身免疫性及AIH的發(fā)病機(jī)理都會有幫助。為此，本課題計劃建立sla/lp基因敲除鼠模型，并對sla

5、/lp基因的啟動子進(jìn)行定位，尋找存在的轉(zhuǎn)錄因子，并確定其在SLA/LP蛋白表達(dá)中的調(diào)控作用。 第一部分：sla/lp基因敲除鼠模型的建立[研究目的] 創(chuàng)建sla/lp基因敲除鼠模型，研究其表型變化，進(jìn)一步闡明SLA/LP功能，同時為SLA/LP功能及AIH的相關(guān)研究提供一個比較理想的動物模型。 [研究方法] (1)利用基因克隆技術(shù)，構(gòu)建基因敲除載體。(2)將基因敲除載體電轉(zhuǎn)到胚胎干細(xì)胞(Rl ES)中，通過同源重組完

6、成基因序列的置換。(3)藥物篩選耐藥克隆，Southern Blot篩選陽性重組子克隆。(4)用顯微注射方法，將發(fā)生重組后的ES細(xì)胞注射到來自C57BL/6鼠的3.5天的囊胚中，并移植到代孕母鼠體內(nèi)，以產(chǎn)生嵌合體小鼠。(5)將雄性嵌合體小鼠與野生型雌性C57BL/6小鼠交配，獲得雜合體小鼠。(6)將雜合體小鼠交配，獲得基因敲除純合體小鼠。(7)分析基因敲除鼠的表型變化。 [結(jié)果] 構(gòu)建的基因敲除載體含有兩個同源序列，分別稱作5

7、’Arm和3’Arm。5，Arm長2007bp，含有從內(nèi)含子2-3到外顯子3的序列；3’Ann長4256bp，含有從內(nèi)含子6-7到外顯子8的序列。同源重組后，將敲掉自外顯子3到內(nèi)含子6-7之間長約5867bp的一段序列。在5，Arm后，加入了EGFP基因；在兩個同源序列之間含有陽性選擇標(biāo)記-新霉素基因；在兩個同源序列之外含有陰性選擇標(biāo)記．單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，用于陽性重組胚胎干細(xì)胞克隆的藥物篩選。將構(gòu)建的基因敲除載體

8、電轉(zhuǎn)到ES細(xì)胞中后，用G418和ganciclovir篩選耐藥克隆。在400多株耐藥克隆中，Southern Blot分析確定了3株陽性重組子克隆。 利用陽性ES細(xì)胞誕生了7只具有高度嵌合性的雄性嵌合體小鼠。因為ES細(xì)胞來自129/Sv小鼠，囊胚來自C57BL/6小鼠，故嵌合體小鼠毛色為黑色和棕色。將嵌合率高于80﹪的雄性嵌合體小鼠與野生型C57BL/6雌鼠雜交后，后代均為黑色，PCR檢測無新霉素基因的存在，未產(chǎn)生應(yīng)該為棕色的

9、雜合體子代小鼠。 [結(jié)論] 基因敲除載體被成功構(gòu)建，且可產(chǎn)生嵌合體小鼠，但是遺傳性狀無法傳遞給子代。需選擇其他陽性ES細(xì)胞克隆重復(fù)進(jìn)行顯微注射，或者構(gòu)建新的敲除載體，以克服遺傳性狀不能傳遞的缺陷。 [研究方法](1)利用基因克隆技術(shù)將一長1740bp的小鼠sla/lp基因片段克隆到熒光素酶報告載體一pGL3 basic vector。(2)將構(gòu)建的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到HEK293，RAW264.7和Hepa1-6這三種不同

10、的細(xì)胞系中進(jìn)行熒光素酶實(shí)驗。(3)熒光素酶實(shí)驗證實(shí)該1740bp片段具有起始轉(zhuǎn)錄功能后，經(jīng)系列5’端剪切和3’端剪切定位核心啟動子位置。(4)利用計算機(jī)軟件預(yù)測可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，檢測對這些位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變后各克隆熒光素酶活性的變化，從而初步確定這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是否存在及其作用。(5)利用凝膠遷移實(shí)驗(EMSA)和超凝膠遷移實(shí)驗(Super shift)對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)加以確認(rèn)。 [結(jié)果](1)1740bp小鼠sl

11、a/lp基因片段位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游并含蓋轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(-1623～+117)。熒光素酶實(shí)驗證實(shí)其具有啟動子活性并且活性具有方向性，表達(dá)在三種細(xì)胞中無差異。(2)經(jīng)過系列剪切后，具有起始轉(zhuǎn)錄功能的最短片段定位于-99～-37，一個長63bp片段內(nèi)。(3)該63bp片段不存在典型的核心啟動子元件，如TATA盒，起始子(Inr)，下游啟動子元件(DPE)和TFIIB識別元件(BRE)。(4)CpGProD和Alibaba2.1軟件預(yù)測，sla/

12、lp基因啟動子很可能是CpG島型啟動子，并預(yù)測在63bp片段內(nèi)存在兩個Spl結(jié)合位點(diǎn)(-85～-76和．55～-41)，一個RAPl結(jié)合位點(diǎn)(-71～-62)。在63bp片段上游存在一個Oct-1結(jié)合位點(diǎn)(-184～-175)。(5)63bp片段內(nèi)的兩個Spl結(jié)合位點(diǎn)及RAPl結(jié)合位點(diǎn)分別經(jīng)過點(diǎn)突變后，所產(chǎn)生的克隆幾乎完全喪失起始轉(zhuǎn)錄的功能；而Oct-1結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變克隆則可以在不同的細(xì)胞系中提高轉(zhuǎn)錄能力2.8到6.3倍。(6)這4個

13、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的凝膠遷移實(shí)驗均出現(xiàn)了滯后帶；其中，Spl(-85～-76)和Oct-1(-184～-176)的Super shift實(shí)驗出現(xiàn)超滯后帶，證實(shí)了這兩個位點(diǎn)的存在；而Spl(-55～-41)和RAPl(-71～-62)結(jié)合位點(diǎn)未出現(xiàn)超滯后帶，故尚不能確定它們一定存在。 [結(jié)論](1)sla/lp基因的啟動子為CpG島型啟動子，核心啟動子位于一個長63bp的片段內(nèi)，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-99～-37的位置，不含有典型的

14、核心啟動子元件，內(nèi)含一個轉(zhuǎn)錄活化因子spl、一個spl樣和一個可能的RAPl結(jié)合位點(diǎn)。其上游含有轉(zhuǎn)錄抑制因子Oct-1結(jié)合位點(diǎn)。(2)SLA/LP蛋白在體內(nèi)正常的廣泛表達(dá)是轉(zhuǎn)錄活化因子Spl，RAPl和轉(zhuǎn)錄抑制因子Oct-1作用之間動態(tài)平衡的結(jié)果。(3)導(dǎo)致該平衡失衡的因素可能是AIH病人產(chǎn)生抗-SLA/LP抗體的基礎(chǔ)。 [總結(jié)]在建立sla/lp基因敲除鼠模型過程中，成功的構(gòu)建了基因敲除載體，并順利地誕生了嵌合體小鼠，但改變

15、后的基因未能成功地傳遞給子代獲得雜合體小鼠，這里面含有許多經(jīng)驗教訓(xùn)，在今后的工作中，許多方面需要給予更多的關(guān)注。在ES細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，要盡量避免或降低各種可能引起分化因素的作用，以最大程度提高遺傳性狀的可傳遞性。 Sla/lp基因的啟動子為CpG島型啟動子，核心啟動子位于一長63bp片段內(nèi)，缺乏典型核心啟動子元件，如TATA box，Inr，DPE，BRE等；轉(zhuǎn)錄因子Spl是sla/lp基因的轉(zhuǎn)錄活化因子， Oct-1為轉(zhuǎn)錄

16、抑制因子，同時還可能存在轉(zhuǎn)錄活化因子RAPl的結(jié)合位點(diǎn)，為一多調(diào)節(jié)因子型啟動子，同時也提示了sla/lp基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。SLA/LP蛋白在體內(nèi)的正常表達(dá)應(yīng)該是Spl/RAPl和Oct-1作用動態(tài)平衡的結(jié)果；引起該平衡失衡的因素可能是導(dǎo)致SLA/LP在AIH中產(chǎn)生自身免疫性的原因之一，因此，進(jìn)一步尋找這些因素將會是非常有意義的工作。 目前找到的調(diào)控sla/lp表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，無論是活化因子還是抑制因子，均是在體內(nèi)廣泛表達(dá)的

17、、無組織特異性的因子，這從一個側(cè)面說明了為什么SLA/LP在體內(nèi)各組織中廣泛表達(dá)，而不具有組織特異性。這些轉(zhuǎn)錄因子的濃度和活性可能是控制sLA/LP蛋白在各組織中表達(dá)量不同的因素之一。同時，這種表達(dá)特點(diǎn)也帶給我們這樣一個問題，即在體內(nèi)廣泛表達(dá)的SLA/LP，為什么在AIH中只影響到肝臟，而不影響其他組織器官呢?是因為SLA/LP在AIH病人肝臟中的異常表達(dá)造成的嗎?但我們的另一個實(shí)驗結(jié)果顯示SLA/LP在AIH、其他肝臟疾病以及健康對照