釀酒酵母Iml3-Chl4復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究以及膜蛋白NPC1的表達(dá)純化.pdf

1、遺傳物質(zhì)的準(zhǔn)確復(fù)制并精確分配到子代細(xì)胞中是生物體存活與延續(xù)的基礎(chǔ)。根據(jù)細(xì)胞分裂類型又可分為有絲分裂和減數(shù)分裂。但無論哪種細(xì)胞分裂，都需要紡錘體的紡錘絲附著在染色體的特定區(qū)域上，最終牽引染色體被拉向細(xì)胞的兩極。人們把這個特定的區(qū)域稱之為著絲粒，大分子復(fù)合物——動粒在著絲粒上進(jìn)行組裝，指導(dǎo)染色體的分離。
　　根據(jù)在動粒上的位置，可將動粒組分分為內(nèi)層動粒蛋白、外層動粒蛋白以及調(diào)節(jié)蛋白。目前一致認(rèn)為內(nèi)層動粒主要由16個CCAN蛋白（哺乳動

2、物類）組分組成，該區(qū)域與著絲粒DNA緊密連接，隨后招募其他的動粒組分。而CENP-L/CENP-N作為CCAN復(fù)合物的核心組成元件，在動粒組裝的上游發(fā)揮作用，并招募其他組分在染色體上裝配。但CENP-L/CENP-N是如何被招募到著絲粒核小體上目前還不是很透徹。
　　本文以釀酒酵母著絲粒動粒蛋白Iml3/Chl4（哺乳動物CENP-L/CENP-N的同源蛋白）為研究對象，解析了Iml3蛋白和Iml3-Chl4378-458復(fù)合物的

3、晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示:Iml3是一個較新的結(jié)構(gòu)組裝模式，主要由兩個分離的結(jié)構(gòu)域組成:不完全的β折疊桶和扭曲的平面，通過分子間的疏水作用維持著整個結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在晶體結(jié)構(gòu)中，盡管一個不對稱單位中只有一個Iml3分子，但它與晶體學(xué)對稱所產(chǎn)生的另一個Iml3分子通過βstrand上的主鏈氫鍵形成同源二聚體。當(dāng)Chl4蛋白存在時，Chl4能破壞Iml3的同源二聚界面，以更加穩(wěn)定的方式結(jié)合Iml3。Chl4的C端形成4個βstrands，以反平行的

4、方式與Iml3的11個βstrands組成一個連續(xù)、延伸的β-sheet，并通過多對氫鍵以及鹽橋相互作用保證了復(fù)合物的穩(wěn)定和結(jié)合特異性。
　　結(jié)構(gòu)分析與文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，Chl4通過與著絲粒Cse4核小體（哺乳動物CENP-A核小體）的直接相互作用被招募，除了Chl4的N端與Mif2蛋白（哺乳動物CENP-C的同源蛋白，具有DNA結(jié)合能力）相互作用的推動，是否還存在其他的作用力促使這個過程的發(fā)生呢？凝膠阻滯和熒光偏振實驗結(jié)果表明，Im

5、l3和Chl4具有協(xié)同結(jié)合dsDNA的能力，而單獨(dú)的Iml3和Chl4都不具有與dsDNA的結(jié)合能力。結(jié)構(gòu)分析及突變體實驗發(fā)現(xiàn)，這種非特異性結(jié)合dsDNA的能力主要來源于Iml3-Chl4復(fù)合物的β-sheet內(nèi)側(cè)堿性富集區(qū)。與幾乎同時發(fā)表的的Stephen et al.研究組的研究表明:破壞Iml3與Chl4的二聚作用界面，直接導(dǎo)致了染色體分離的準(zhǔn)確性以及使孢子的生成率降低，他們將此現(xiàn)象的最終原因歸結(jié)為異源二聚界面的破壞。我們的凝膠阻

6、滯以及熒光偏振等實驗表明，異源二聚界面的破壞只是表象，二聚界面的破壞導(dǎo)致了Iml3-Chl4復(fù)合物上的β-sheet內(nèi)層表面的堿性殘基富集區(qū)被破壞，從而失去了dsDNA的結(jié)合能力，這可能直接阻礙了自身的著絲粒定位以及其下游內(nèi)層動粒蛋白的招募，從而抑制了動粒的組裝，最終影響了染色體的分離。
　　膽固醇作為一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，廣泛存在于動物的腦及神經(jīng)組織中，為哺乳動物生長發(fā)育所必須，同時也是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分。但是作為兩性

7、分子，膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)以及信號傳導(dǎo)既需要可溶蛋白的協(xié)助，又需要膜蛋白的參與。
　　在哺乳動物中，膽固醇除了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的從頭合成，還涉及到外源性攝取:低密度脂蛋白結(jié)合到低密度脂蛋白受體上，隨后內(nèi)化進(jìn)早期內(nèi)涵體，在酸性pH的作用下，兩者解離。低密度脂蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至晚期內(nèi)涵體，經(jīng)溶酶體酶水解成自由膽固醇，在可溶蛋白NPC2/膜蛋白NPC1的協(xié)同作用下，轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)涵體。當(dāng)NPC2/NPC1基因發(fā)生突變時，會引起自由膽固醇在內(nèi)涵體中的積累，在人源中這

8、種疾病稱為Niemann-Pick type C(NPC)疾病。可以看出，膜蛋白NPC1是一種非常重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。近來研究發(fā)現(xiàn)，NPC1還可以作為某些包膜絲狀病毒感染宿主細(xì)胞的受體蛋白，幫助絲狀病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、組裝。但膜蛋白NPC1是如何既作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白幫助膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，又作為受體蛋白幫助子代病毒感染宿主細(xì)胞還不是很透徹。
　　本文以膜蛋白NPC1為研究對象，成功克隆了NPC1蛋白在不同物種中的50個同源蛋白，篩選出了能在p